γδT细胞作为T细胞中的一个亚群,其识别抗原的方式与αβT细胞不同,γδT细胞通过(major histocompatibility complex, MHC)限制性方式识别肿瘤相关抗原,发挥免疫调控作用。目前,不少研究报道了γδT细胞及其亚群在感染、自身免疫性疾病以及抗肿瘤免疫监视中发挥重要的作用,因此,这类细胞应用于临床的肿瘤免疫治疗有着光明前景。尽管近年来γδT细胞在临床上治疗难治耐药的恶性肿瘤取得一定进展,但是大部分恶性肿瘤患者对这类细胞无反应,或者缓解后复发。本实验室前期的体外研究也发现急性髓系白血病细胞(acute myeloid leukemia, HDAC的nRNA表达水平无显著变化,HDAC6和HDAC10的mRA表达较未处理的稍降低,有少部分HDAC家族成员,如HDAC9和HDA感。因此,γδT细胞的临床应用仍然阻碍重重。γδT细胞的活化依赖于其表面受体对抗原的识别,活化后的γδT细胞产生生物学效应,分泌细胞因子或发挥细胞毒效应。但是,对γδT细胞杀伤不敏感的肿瘤细胞大多由于表面抗原无法识别或发挥负调控机制,导致丫δT细胞未能活化。令人兴奋的是,研究者发现了一些药物,如双膦酸类化合物可作为类似抗原的刺激物,促进γδT细胞增殖和活化,增强抗肿瘤活性。因此,采用药物调控γδT细胞免疫反应并促进杀伤功能的方案可能更易于提高恶性肿瘤的免疫治疗效果。由于对γδT细胞活化和抗肿瘤机制的认识非常有限,目前可用于调控γδT细胞生物学特性、激活其功能的药物属于未知的领域。那么,是否有合适的抗肿瘤药物可作为促进γδT细胞功能的理想药物呢?只有探索和寻找合适的药物并深入研究其对γδT细胞的调控机制,才能有效提高γδT细胞在抗肿瘤免疫治疗中的效果。我们实验室前期研究发现去甲基化药物地西他滨可促进调节性γδT细胞(regulatory γδT,γδTreg)细胞增殖,并增强对移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)的抑制效应。其他研究者发现,组蛋白去乙酰化酶抑制剂可导致T细胞激活,CD8+T细胞以及NK细胞表面激活型受体受组蛋白乙酰化调控。更多的研究表明,T细胞的功能性基因与表观遗传修饰密切相关,而组蛋白去乙酰化酶抑制剂在临床多用于治疗T细胞相关的血液系统肿瘤。鉴于此,我们推测组蛋白去乙酰化酶抑制剂可作为调控γδT细胞功能的理想药物。在第一部分研究中,本课题采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589处理人γδT细胞,研究结果发现低浓度的LBH589(<5nM)对γδT细胞的扩增无显著影响,如克隆形成能力、γδT细胞占外周血单个核细胞比例以及γδT细胞绝对数量均未出现明显变化；但较高浓度或高浓度的LBH589(>5nM)则显著抑制γδT细胞扩增,γδT细胞克隆形成数量减少,绝对数量明显下降,但在外周血单个核细胞中的比例无显著下降。随LBH589浓度增加,γδT细胞表面活化分子CD69和CD25表达水平均未发生改变,各处理组γδT细胞免疫表型均大部分为CD45RA-/CD27-的效应记忆型细胞。与杀伤功能相关的活化性受体NKG2D (natural killer group2, member D)高表达于γδT细胞,并且不随LBH589浓度增加而改变。我们还检测γδT细胞表达IFN-γ的能力,结果发现LBH589并未对IFN-γ的表达产生影响。为进一步研究LBH589对γδT细胞的细胞毒性效应影响,我们选择对γδT细胞不敏感的AML细胞株作为靶细胞。LBH589预处理γδT细胞后以不同效靶比对AML细胞株进行杀伤,发现在较高或高浓度的LBH589(≥10nM)预处理后,γδT细胞对原先不敏感的AML细胞株(HL-60)杀伤效应增强,具有显著统计学差异。但对另一型的AML细胞株(KG-1)的杀伤效应无增强作用。研究结果提示LBH589对γδT细胞的扩增有显著抑制效应,但是对其表面活化分子以及免疫表型、细胞因子表达无明显影响。与抑制增殖相反的是,LBH589可显著增强γδT细胞的杀伤功能。因此,本研究首次发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂促进γδT细胞的细胞毒性效应,并且不会影响其活化状态及细胞因子表达,该结果可为提高血液系统恶性疾病患者采用过继输注或激活自体γδT细胞行免疫治疗的疗效提供实验室数据支持。γδT细胞表面活化型受体与抗原识别后发出信号,传递至胞内,激活一系列信号传导通路,如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)通路,此外,Notch信号通路也被发现参与γδT细胞的活化和杀伤作用。但是究竟哪条通路与γδT细胞杀伤AML细胞的功能相关?LBH589增强γδT细胞细胞毒效应与这些信号通路是否有关,或者有另外的信号通路参与这一过程?对此,我们进行深入研究。第二部分研究发现,LBH589并不抑制γδT细胞的组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)的mRNA表达水平,HDAC蛋白表达也无显著影响。随着LBH589处理γδT细胞时间延长或处理浓度增加,ERK、JNK、Akt等蛋白均未发生磷酸化,并且JNK总蛋白表达水平还随着时间增加而降低,但ERK上游蛋白Raf-1随时间延长持续高表达；我们另外发现Notch2蛋白表达显著升高,但其下游转录因子RBP Jκ表达无显著改变。Notch抑制剂可逆转LBH589对γδT细胞杀伤增强的效应,提示Notch信号通路与γδT细胞杀伤功能相关。此外,我们发现γδT细胞凋亡通路的蛋白表达水平未见明显改变,提示LBH589对γδT细胞扩增的抑制不是通过促进其凋亡,可能是通过其他生存、增殖相关信号通路,调控γδT细胞的生存和凋亡过程。因此,本研究表明Notch通路被LBH589激活后,参与调节γδT细胞的杀伤效应。Notch通路可作为γδT细胞发挥抗肿瘤功能作用的触发点,提高γδT细胞的免疫治疗效果。综上所述,我们的研究首次发现γδT细胞杀伤血液系统恶性肿瘤的效应可通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂获得提高,并且不会影响免疫调节功能,Notch信号通路参与组蛋白去乙酰化酶抑制剂对γδT细胞的调控作用,研究其具体机制可为优化血液系统恶性疾病的免疫治疗提供新策略。