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目的:TGF-β1是TGF-β超家族中的成员之一,在胚胎发育、肿瘤的发生发展及组织创伤愈合等方面起着重要作用,20多年来科学家们对其研究热忱从未消退。皮肤色素过度沉着长期以来始终是困扰女性皮肤审美的问题之一,近来有文献报道TGF-β1是脂肪干细胞发挥美白作用的重要角色,另也有文献报道TGF-β1可加速酪氨酸酶(黑色素生成限速酶)的降解从而减少黑色素的生成。由此大胆设想,通过局部用药抑制皮肤色素过度沉着可能是TGF-β1在现有功能之外的另一有较大潜在应用价值的领域,因此,采用基因工程手段建立其高效生产方法是实现TGF-β1应用的基础。本实验通过构建hTGF-β1两种不同重组质粒,分别转化至大肠杆菌及毕赤酵母表达宿主对其表达进行研究,并利用小鼠黑色素瘤细胞建立重组hTGF-β1抑制黑色素生成活性的评价体系,旨在建立完善的高效制备重组hTGF-β1的方法,为其在更多领域的开发与应用奠定基础。方法:1、重组hTGF-β1在大肠杆菌系统中的构建与表达采用大肠杆菌偏爱密码子优化hTGF-β1的编码序列,首尾两端引入酶切位点及保护碱基。PCR法扩增目的基因,并同时对插入片段及表达载体pET21b进行双酶切,体外连接将插入片段插入表达载体相应位点获得重组质粒。热击法将重组质粒转化至克隆宿主E.coli DH5α并进一步转化至表达宿主E.coli BL21(DE3),SDS-PAGE电泳分析,筛选高表达工程菌并确定目的蛋白的表达形式。超声破碎获得包涵体并用8 mol/L urea将其裂解,利用弱阳离子交换层析及分子筛层析法对包涵体蛋白进行纯化,并用稀释法对包涵体蛋白进行复性。2、重组hTGF-β1/C77S在毕赤酵母系统中的构建与表达将hTGF-β1成熟肽中第77位半胱氨酸突变为丝氨酸,按毕赤酵母偏爱密码子优化hTGF-β1/C77S的编码序列,首端引入保护碱基、酶切位点及信号肽基因,末端引入His标签、酶切位点及保护碱基。PCR扩增目的基因,双酶切法构建重组质粒pGAPzαA-hTGF-β1/C77S。Xho I酶线性化重组质粒经电击法转化至表达宿主Pichia X33,高抗性平板筛选高拷贝重组子,PCR法鉴定重组子,并利用SDS-PAGE、免疫点印迹、Weston Blot分析表达情况。3、重组hTGF-β1的生物学活性检测MTT法检测制备出的hTGF-β1对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞增殖抑制的影响,并采用碱裂解法检测其有无抑制B16-F10细胞黑色素生成的生物活性。结果:1、利用大肠杆菌表达系统,成功将hTGF-β1成熟肽编码序列克隆至表达载体并筛选出高表达工程菌,通过层析柱分离纯化得到纯度95%以上包涵体蛋白,经稀释复性后得到了性质稳定的hTGF-β1溶液。2、利用毕赤酵母表达系统,成功将hTGF-β1/C77S编码序列克隆至表达载体pGAPzαA并转化至毕赤酵母X33中,Weston Blot结果表明重组hTGF-β1单体可在毕赤酵母中有效表达,其中目的蛋白总表达量的20%左右可被有效分泌至胞外。3、MTT结果表明,重组hTGF-β1对小鼠B16-F10细胞无增殖或抑制作用;黑色素生成抑制实验结果表明,重组hTGF-β1具有抑制黑色素生成的活性。结论:本研究证明了重组hTGF-β1均可在大肠杆菌及毕赤酵母中表达,并成功建立了利用大肠杆菌表达系统制备重组hTGF-β1的方法,并通过细胞实验证明了制备出的hTGF-β1具有黑色素生成的抑制活性。