研究背景及目的肺癌是高发病率癌症之一,并且肺癌细胞具有显著的“嗜脑性”。脑微环境是一个相对独立的功能区,由脑微血管内皮细胞以及神经细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞共同构成的神经血管单元（neurovascular units,NVU）维持脑微环境的稳态。肿瘤与脑微环境之间的相互作用促成了肿瘤在脑内定植生存的结局。随着生物信息学的发展,研究人员发现转移的肿瘤细胞基因重新编程,从而获得适应新环境生长的细胞特征,并且原发肿瘤和脑转移瘤虽然拥有共同的祖先,但在转移部位发生了截然不同的进化模式,也证明了肿瘤细胞具有可塑性。最近有关癌症恶性表型的研究已将解锁肿瘤细胞表型可塑性列入其中,深入了解脑转移肺癌细胞在脑微环境的影响下如何获得并呈现肿瘤细胞可塑性,对完善疾病的认识以及治疗至关重要。多项研究在基因水平上证明了脑转移的肿瘤细胞,包括肺癌、乳腺癌、黑色素瘤,在脑微环境诱导下发生重编程,存在轴突引导和突触发生基因的激活,神经细胞特性增强,并呈现出个体早期神经发育的某些特征。肿瘤神经支配领域越来越受到关注,癌细胞与神经元形成突触连接促进了肿瘤的恶性表型进展。研究表明,在大脑中,癌细胞和神经元在细胞之间形成的兴奋性突触连接,可促进肿瘤的生长。癌细胞与神经元之间可通过神经递质的释放产生联系,影响肿瘤在大脑中定植,细胞浸润、迁移及增殖。肿瘤研究模型的建立对深入研究肿瘤发生发展的机制很重要。肿瘤形成具有复杂的微环境,细胞发生异常并且具有立体三维结构。为此,本研究将从动物实验层面、脑组织培养层面以及细胞层面,解析肺癌脑转移后的恶性表型进展。利用GEO数据库,对脑转移后的肺癌细胞较亲本细胞上调的差异表达基因进行分析,并且结合本课题组前期研究获得的生物信息数据,筛选到脑转移肺癌较原位肺癌过表达的发育保守基因HOX家族中的一员——HOXB9。HOX家族被称为同源异型盒基因家族,其编码高度保守的同源异型转录因子,是细胞分化和增殖调控基因。胚胎发育中,HOX基因在多种动物的轴向构型、调节细胞及组织的区域特性中起关键作用。脊椎动物相关研究发现,HOX基因在发展特定区域的神经回路和使运动神经元多样化方面具有重要意义。HOX基因在神经元发育过程中的功能包括神经细胞亚型决定、神经元迁移、轴突引导、轴突分支形成、神经元回路连接。对有丝分裂后神经元形成回路也是必需的,包括突触的形成和成熟、神经回路调整。此外,HOX基因也影响多种类型神经细胞的存活和功能。HOXB9作为HOXB簇中的成员,具有高度的保守性,人源HOXB9基因与鼠源相似性达到95.87%。HOXB9的异常表达影响着肿瘤的形成。研究表明,过表达的HOXB9与肺腺癌患者的预后不良、结肠癌患者总生存率低、乳腺癌患者的肿瘤分级高和总生存率低、胶质瘤患者的晚期临床分期等相关。研究报道HOXB9在肿瘤发生发展上发挥的作用,包括诱导肿瘤细胞EMT、影响细胞增殖或是促进血管生成。本研究将探讨曾经参与个体神经发育的保守基因HOXB9如何驱动肺癌细胞获得脑内定植生存的能力,从发育的角度解释肿瘤恶行表型的转变,为探明肿瘤细胞可塑性的分子机制研究提供实验佐证,并为临床防治肺癌脑转移提供潜在的风险预测因子和干预靶点。研究方法一、探讨肺癌细胞脑转移后细胞表型的变化1、利用C57小鼠脑原位注射小鼠肺癌LLC细胞成瘤,建立迭代脑转移肺癌细胞系LLC-Br M1、LLC-Br M2、LLC-Br M3,MTS检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期。利用H2O2诱导细胞凋亡,流式细胞术检测凋亡率评估细胞生存能力。利用Transwell细胞小室评估LLC-Br M3细胞的侵袭及迁移能力。利用Matrigel培养LLC细胞及LLC-Br M3细胞形成具有三维（3D）结构的细胞球,光学显微镜观察细胞球的形态,并通过检测细胞ATP含量评估细胞球活力。利用球形微孔板培养LLC细胞及LLC-Br M3细胞形成细胞球,光学显微镜观察细胞球的生长情况。2、利用球形微孔板培养携带GFP的LLC细胞及LLC-Br M3细胞形成细胞球,建立细胞球与C57小鼠脑组织切片共培养体系。利用荧光体视显微镜观察细胞球在脑组织切片上的生长情况。利用免疫荧光结合激光共聚焦荧光显微镜观察细胞球中神经标志物PSD95及MAP2的表达及分布情况。3、用含有GFP c DNA的慢病毒感染人肺腺癌A549细胞,利用球形微孔板培养GFP标记的人肺腺癌A549细胞进行无细胞外基质支持物的3D细胞球培养,进一步建立A549细胞球与裸鼠脑组织切片共培养体系。利用免疫荧光对脑组织切片标记血管标志物CD31,激光共聚焦荧光显微镜观察A549细胞球生长及形态变化情况。利用免疫荧光结合激光共聚焦荧光显微镜观察细胞球中神经标志物PSD95及MAP2的表达及分布情况。4、利用Western Blot检测LLC-Br M3细胞、与小鼠脑组织切片共培养的LLC细胞以及与裸鼠脑组织切片共培养的A549细胞中PSD95及MAP2的表达水平,评估以上不同脑微环境影响下肺癌细胞中神经标志物的表达情况。5、利用生物信息学分析Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中脑转移肺腺癌PC9细胞及亲本细胞的转录组测序数据。二、探讨脑微环境中HOXB9介导肺癌细胞向类神经细胞样改变的可能机制1、结合本课题组前期研究获得的生物信息数据,筛选可能影响肺癌细胞获得类神经细胞表型的候选因子。利用Real-time PCR及Western Blot检测LLC、LLC-Br M1、LLC-Br M2、LLC-Br M3各细胞中HOXB9的表达情况。利用Real-time PCR及Western Blot检测与裸鼠脑组织切片共培养的A549细胞中HOXB9的表达情况。2、下调LLC-Br M3细胞中HOXB9的表达,同时建立过表达HOXB9的LLC细胞株;利用Matrigel建立3D细胞球培养体系,光学显微镜观察细胞球形态变化情况。同理,干预A549细胞中HOXB9的表达水平,重复前述3D细胞球实验。3、利用激光共聚焦荧光显微镜观察过表达HOXB9的LLC细胞的细胞形态变化情况及神经标志物MAP2的标记情况;将3D培养的该细胞球与小鼠脑组织切片共培养,激光共聚焦荧光显微镜观察细胞球外周细胞的细胞形态变化情况及MAP2的表达分布情况。4、利用Real-time PCR及Western Blot检测下调HOXB9的LLC-Br M3细胞及过表达HOXB9的LLC细胞中MAP2的表达情况,评估小鼠肺癌细胞中HOXB9与MAP2表达的相关性。5、利用激光共聚焦荧光显微镜观察过表达HOXB9的A549细胞的细胞形态变化情况及神经标志物MAP2、PSD95的标记情况。利用Transwell小室（上室为裸鼠脑组织切片,下室为过表达HOXB9的A549细胞）建立共培养体系,激光共聚焦荧光显微镜观察下室A549细胞形态变化情况及MAP2、PSD95的表达分布情况。6、利用RNA-seq技术分析过表达HOXB9的A549细胞基因表达谱变化情况,获得的差异基因进行基因功能分析。7、利用过表达HOXB9的A549细胞,结合Ch IP-seq技术分析HOXB9免疫沉淀富集的DNA序列,获得HOXB9作为转录因子调控的下游靶基因。将Ch IP-seq与RNA-seq的测序数据联合分析,筛选HOXB9作为转录因子调控与肺腺癌细胞突起形成相关的下游靶基因。8、利用Real-time PCR及Western Blot在LLC-Br M3细胞、过表达HOXB9的LLC细胞以及过表达HOXB9的A549细胞中验证获得的候选基因表达情况。9、过表达HOXB9的A549细胞经si RNA下调Slit2,与裸鼠脑组织切片共培养后,利用激光共聚焦荧光显微镜观察细胞形态变化情况及神经标志物PSD95、MAP2的表达分布情况,利用Western Blot检测细胞中PSD95及MAP2的蛋白表达水平。10、动物实验:C57小鼠脑原位注射过表达HOXB9的LLC细胞,利用荧光体视显微镜观察小鼠脑内成瘤情况,对小鼠全脑组织石蜡包埋并组织切片后经HE染色确定成瘤面积。细胞实验:利用Transwell细胞小室建立小鼠脑组织切片与肺癌细胞共培养体系,CCK8检测过表达HOXB9的LLC细胞、过表达HOXB9的A549细胞、过表达HOXB9的A549细胞经si RNA下调Slit2后,分别与脑组织切片共培养后的细胞存活率。利用H2O2诱导下调HOXB9的LLC-Br M3细胞凋亡,流式细胞术分析细胞凋亡率。利用MTS检测下调HOXB9的LLC-Br M3细胞的细胞活力改变情况,流式细胞术分析细胞周期变化情况,评估HOXB9对LLC-Br M3细胞生存能力的影响。11、分析HOXB9在临床肺癌病理组织样本中的表达情况:利用免疫组化检测肺腺癌组织芯片中HOXB9的表达情况;利用GEO数据库分析不同类型肿瘤的原位癌及脑转移癌中HOXB9的表达情况;利用TCGA数据库中肺腺癌患者样本数据分析HOXB9的表达情况,以及HOXB9与患者的生存期、临床病理分期的相关性。研究结果一、脑微环境中的肺癌细胞获得向神经样细胞表型转变的潜能1、利用MTS检测LLC、LLC-Br M1、LLC-Br M2、LLC-Br M3以上不同类型细胞活力。结果表明,脑转移后的肺癌细胞其细胞活力显著增强,并且LLC-Br M3细胞的细胞活力明显强于前两代的细胞（LLC-Br M1及LLC-Br M2）。流式细胞术检测细胞周期结果表明脑转移后的肺癌细胞的G2/M期延长,并且LLC-Br M3细胞比LLC-Br M1细胞及LLC-Br M2细胞的G2/M期延长。利用H2O2诱导细胞凋亡,流式细胞术检测结果表明,LLC-Br M3细胞的凋亡率较LLC-Br M1、LLC-Br M2细胞显著降低。Transwell细胞小室检测LLC-Br M3细胞的侵袭能力及迁移能力,结果表明LLC-Br M3的侵袭能力及迁移能力也显著增强。细胞3D培养显示,Matrigel-3D培养的LLC-Br M3细胞球形成了明显的突起样结构。以细胞球ATP含量分析其细胞活力发现LLC-Br M3细胞球的细胞活力明显强于LLC细胞球。球形微孔板-3D培养的LLC-Br M3细胞球呈现弥散状生长,而LLC细胞球则呈现聚集状生长状态。以上结果提示了肺癌细胞在脑内生存后获得了更为显著的恶性表型,其生存的能力明显增强。2、用GFP标记LLC-Br M3细胞,建立的3D细胞球与小鼠脑组织切片共培养后,荧光体视显微镜观察发现细胞球外周出现放射状生长的细胞,并呈现向四周扩散状。激光共聚焦荧光显微镜下可观察到LLC-Br M3细胞球迁延出的细胞呈长梭形,具有明显的极性,细胞内出现神经标志物PSD95及MAP2的表达。3、用GFP标记人肺腺癌A549细胞,建立的3D细胞球与裸鼠脑组织切片共培养,激光共聚焦荧光显微镜观察可见A549细胞呈现出类神经细胞样形态,形成长突起样结构,突起内出现神经标志物PSD95及MAP2的表达,并且PSD95蛋白在突起末端呈现明显的聚集性分布。4、利用Western Blot检测LLC-Br M3细胞以及与小鼠脑组织切片共培养的LLC细胞、与裸鼠脑组织切片共培养的A549细胞中PSD95及MAP2的表达情况,结果表明,以上不同的脑微环境影响下肺癌细胞内神经标志物PSD95及MAP2的表达水平较对照细胞均升高。5、进一步利用生物信息学分析发生脑转移的肺癌细胞内基因表达谱变化情况,结果表明,差异基因富集在与神经细胞功能相关的基因子集中,包括神经发育,轴突形成,突触发生等。二、HOXB9调控Slit2诱导脑转移肺癌细胞向神经样细胞转变影响其恶性表型1、结合我们既往的前期研究结果,筛选到可能与肺癌细胞获得类神经细胞表型相关的候选基因——HOXB9。利用Real-time PCR及Western Blot检测LLC、LLC-Br M1、LLC-Br M2、LLC-Br M3各细胞中HOXB9的表达情况,结果表明,脑转移后的肺癌细胞中HOXB9的表达水平显著升高,并且LLC-Br M3细胞中HOXB9的表达水平高于LLC-Br M1及LLC-Br M2。利用Real-time PCR及Western Blot检测与裸鼠脑组织切片共培养的人肺癌A549细胞中HOXB9的表达情况,结果表明,与脑组织切片共培养后的A549细胞中HOXB9的表达水平显著升高。以上结果提示肺腺癌脑转移后,在脑微环境的影响下,肺腺癌细胞中HOXB9的表达水平升高。2、建立下调HOXB9的LLC-Br M3细胞株及过表达HOXB9的LLC细胞株。利用Matrigel-3D培养建立具有三维结构的细胞球。光学显微镜观察到下调LLC-Br M3细胞内HOXB9的表达水平可以抑制细胞球周围突起样结构的产生。反之,LLC细胞内HOXB9表达增多则促进了细胞球周围突起样结构的产生。同样,过表达HOXB9同样可以促进人肺腺癌A549细胞球周围产生突起样结构。提示HOXB9影响3D培养的脑转移肺癌细胞球突起样结构的形成。3、激光共聚焦荧光显微镜观察到过表达HOXB9的LLC细胞形态发生显著改变,有突起样结构形成,并且在突起结构中有神经标志物MAP2表达。利用球形微孔板获得过表达HOXB9的LLC细胞球,将该细胞球与小鼠脑组织切片共培养后发现细胞球外周细胞呈放射状生长,细胞形态向类神经细胞样形态转变,细胞中有MAP2表达。4、利用Real-time PCR及Western Blot检测下调HOXB9的LLC-Br M3细胞以及过表达HOXB9的LLC细胞中MAP2的表达情况,结果表明,下调HOXB9的LLC-Br M3细胞中MAP2的表达水平降低,反之,过表达HOXB9的LLC细胞中MAP2的表达水平升高。5、利用激光共聚焦荧光显微镜观察过表达HOXB9的A549细胞的细胞形态变化情况及神经标志物MAP2、PSD95的表达分布情况,结果显示过表达HOXB9的A549细胞中有部分细胞形成明显的突起样结构,且突起结构中有MAP2及PSD95表达。利用Transwell细胞小室建立共培养体系（上室培养裸鼠脑组织切片,下室培养过表达HOXB9的A549细胞）,激光共聚焦荧光显微镜观察发现过表达HOXB9的A549细胞明显地呈现出类神经细胞样形态转变,且单个细胞的分支突起样结构明显增多,突起结构内有神经标志物MAP2及PSD95的表达。6、利用RNA-seq技术分析过表达HOXB9的A549细胞基因表达谱变化情况,对获得的差异基因进行GO和KEGG富集分析,结果显示有多项与神经功能相关的基因子集被富集,包括轴突生成、轴突引导、轴突延伸及轴突转运,并且KEGG富集到轴突引导信号通路。7、利用过表达HOXB9的A549细胞进行Ch IP-seq分析HOXB9免疫沉淀富集的DNA序列,结果显示,HOXB9 Ch IP Peak分布在基因组功能区中的启动子区的比例为7.22%。将Ch IP-seq与RNA-seq的测序数据进行联合分析,富集HOXB9作为转录因子上调的基因子集,筛选到HOXB9作为转录因子调控与肺腺癌细胞突起形成相关的下游靶基因Slit2/Robo。8、Real-time PCR及Western Blot结果表明LLC-Br M3细胞中Slit2表达水平显著升高,过表达HOXB9的肺腺癌细胞中Slit2表达水平也显著升高,并且作为Slit2受体的Robo家族基因的表达水平相应增加。9、过表达HOXB9的A549细胞经si RNA下调Slit2,与裸鼠脑组织切片共培养后,利用激光共聚焦荧光显微镜观察到细胞不能形成突起样结构,PSD95蛋白聚集于细胞内,细胞中MAP2的表达显著减少,Western Blot检测也验证到PSD95及MAP2的蛋白表达水平显著降低。10、C57小鼠脑内成瘤实验证表明,过表达HOXB9的LLC细胞脑内成瘤能力明显增强。体外实验,利用Transwell细胞小室建立脑组织切片与肺癌细胞共培养体系,CCK8检测发现脑微环境下过表达HOXB9的LLC细胞及A549细胞的细胞存活率显著提高,过表达HOXB9的A549细胞经si RNA下调Slit2后在脑微环境下细胞存活率显著降低。下调HOXB9的LLC-Br M3细胞凋亡率显著上升。并且下调HOXB9的LLC-Br M3细胞的细胞活力降低,同时细胞周期的S期及G2/M期缩短。11、利用免疫组化检测肺腺癌组织芯片中HOXB9表达情况,结果显示,肺腺癌组织中HOXB9表达水平高于癌旁组织;发生脑转移的脑内肺腺癌组织中HOXB9表达水平略高于原位肺腺癌组织,但HOXB9的表达水平与淋巴结转移无关。GEO数据库分析表明,在发生脑转移的肺腺癌、乳腺癌病理组织中HOXB9的表达水平均高于原位癌。进一步的TCGA数据库分析表明,HOXB9高表达的肺腺癌患者其生存期较短,但HOXB9表达水平与肺腺癌临床病理分期无显著相关性。研究结论1、发生脑转移的肺癌细胞相较于原位肺癌细胞具有更为显著的恶性表型,并且细胞形态发生类神经细胞样变化,神经标志物表达水平升高,获得了类神经细胞样分化表型。2、高表达HOXB9的肺癌细胞更适应在脑内生存,并且HOXB9的表达促进了肺癌细胞向类神经细胞样形态转变,帮助肺癌细胞更好的适应脑微环境。3、HOXB9通过调控轴突形成蛋白Slit2/Robo通路介导肺癌细胞获得类神经细胞表型,促进其脑内生存。