研究背景与目的作为发病率和死亡率最高的肿瘤,肺癌已成为人类健康的第一杀手,而非小细胞肺癌约占肺癌的85%。在中国,由于吸烟人数无法得到良好的控制,肺癌的发病率和死亡率逐年攀升。过去30年内,我国肺癌死亡率至少上升了 465%,肺癌已成为上升速度最快的肿瘤,并且已取代肝癌成为我国首位肿瘤死亡原因。目前我国肺癌的发病率每年增长26.9%,如不及时采取有效控制手段,预计到2025年,我国肺癌患者将达到100万,成为世界第一肺癌大国。肺癌的病因至今尚不完全清楚,大量研究结果表明,长期大量吸烟是肺癌的一个重要致病因素。约86%的肺癌与吸烟有关,其中3%的肺癌与被动吸烟相关。空气污染也是肺癌的另一个重要因素,随着全球工业化的迅速发展,重工业带来了大量3,4-苯并芘、氧化亚砷、放射性物质、不燃的脂肪族碳氢化合物等致癌物质,这些都严重威胁人们的呼吸系统健康。但是作为一种复杂的多基因疾病,肺癌的发病机制至今尚不明确。肺癌的早期症状较少,因症状就诊者通常为中晚期,疗效不佳。因此,早期诊断早期治疗是提高肺癌生存率的关键,但是目前全世界尚缺乏经济有效的肺癌筛选方案。当前肺癌筛查最经济的方法为X线片和痰细胞学检查,但是由于灵敏度低和容易污染等原因,这两种方法漏诊率较高。迅速发展的影像学技术也给肺癌的筛查提供了新的工具,低剂量螺旋CT由于灵敏度高、安全性佳已成为肺癌早期筛选的合适选择之一。但CT诊断也有其不足,如价格偏高和对中央型肺癌早期发现率低等。随着分子生物学技术的不断发展,肿瘤标志物的研究与筛选已成为肺癌早期诊断的热点。目前,癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA19-9)、细胞角质蛋白19片段(cyfra-21-l)等血清标志物已广泛应用于肺癌的临床诊断、疗效评价、复发或转移监测、预后判断,但敏感性与特异性都较低,尚未能用于肺癌高危人群的筛查。目前肺癌的治疗主要有四大基本手段:外科手术治疗、放疗、化疗及靶向治疗。手术治疗、放疗及化疗等传统的治疗手段,虽然对肺癌起到一定的疗效,但对患者长期生存的改善作用较小。主动靶向治疗技术因其高效、安全的治疗效果而成为当前肺癌治疗研究的焦点之一,当前关于肺癌靶向治疗药物的研究,主要集中在表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂、肿瘤血管生成因子抑制剂以及多靶点抑制剂等方面。EGFR是属于erbB(HER)家族的一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白,约40%-50%NSCLC中EGFR高表达。目前表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼在NSCLC治疗中已经取得明显疗效。血管内皮生长因子(VEGF)是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素,是目前已知的参与肿瘤血管形成特异性最高、功能最强的血管生成调控因子,VEGF亚型的表达变化在肿瘤发生、发展过程中起了重要的作用。目前已用于临床的包括抗VE GF单克隆抗体贝伐单抗(bevacizumab)、凡德他尼(vandetanib)、重组内皮抑素(e ndostatin)、沙利多胺(thalidomide)等。但是,多数靶向药物的有效率只是在10%左右,究其原因是大部分肿瘤都是多靶点、多环节的调控过程,而目前靶向药物大多数是针对单一靶点,而且肿瘤靶点在不同个体的差异性大。因此,寻找早期筛查肺癌,预测肺癌的侵袭、转移、复发和判断预后的特异性功能基因,为肺癌研究提供新的靶点和预后指导,进行早期诊断及针对性、个体化的治疗,延长患者生存期,是目前肺癌研究的重点和难点。基因芯片技术是21世纪科学领域的一项新起的重要技术,是筛选差异基因的高效途径,具有快速、精确、高效等特点。为肿瘤的发生机制、肿瘤分型、早期诊断、靶向治疗及预后评估等生命科学研究领域提供了强有利的工具。随着基因芯片的广泛应用,产生了海量丰富而复杂的数据,如何解读这些庞大的数据,揭示其中蕴含的规律成为了限制基因芯片迅速发展的瓶颈。生物信息学解开了这个难题,生物信息学综合运用了生物学、计算机科学和信息技术以揭示庞大而复杂的生物学数据,它以生物芯片研究为基础,通过序列比对、统计学分析方法、可视化作图、聚类分析、功能诠释、通路分析和启动子预测等方法,在分子水平对数据进行挖掘、对疾病的发生发展过程进行阐述,为肿瘤的的发生机制的深入研究提供了新的思路。因此,本课题运用生物信息学方法对肺癌组织基因表达谱数据进行筛选和分析,结合文献挖掘发现新的非小细胞肺癌(NSCLC)相关基因SUSD2,首先在临床标本中和非小细胞肺癌细胞中进行基因表达水平检测,再通过上调和下调该基因在细胞中的表达水平进行生物学功能研究,最后通过基因芯片表达谱芯片检测上调和下调SUSD2基因引起的基因表达谱的变化,寻找可能相关的作用途径,以期为进一步揭示NSCLC的发病机制、分子诊断、靶基因治疗等研究提供理论基础。研究方法1、以NSCLC相关的两个组织标本芯片表达谱数据GSE18842、GSE19188为研究材料,导入生物信息学软件QlucoreOmics Explorer(QOE)分析筛选NSCLC与正常肺组织的差异表达基因,veny作图交叉两组数据,得到共同上下调表达的差异基因。然后利用DAVID对差异基因进行生物信息学分析,再通过iHOP文献挖掘工具筛选新的NSCLC相关基因,并进一步进行结构功能分析预测基因功能。2、通过检测多种NSCLC细胞株的SUSD2mRNA和蛋白质表达情况,观察了 SUSD2在NSCLC细胞株中的表达水平;利用q-PCR和WB技术检测24例接受肺癌切除手术的NSCLC患者标本以及对应癌旁组织肺标本中SUSD2的表达情况;同时运用免疫组化检测了 SUSD2在160例NSCLC及32例正常肺组织中的表达水平,并初步分析了 SUSD2与NSCLC的临床病理学特征之间的关系。3、构建SUSD2过表达载体及干扰载体,筛选SUSD2上调表达的稳定细胞株H322和SUSD2下调表达的稳定细胞株A549,WB检测其转染效率,将细胞分为过表达组[SUSD2(+)vs Vector]和干扰组[SUSD2(-)vs shRNA-sramble],用CCK-8比色法和平板克隆形成实验检测细胞增殖活性,平板粘附实验检测细胞的粘附能力,transwell实验检测细胞的运动侵袭能力,流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡情况。4、通过Agilent人类全基因组表达谱芯片检测SUSD2过表达组和干扰组细胞基因,筛选显著差异基因,进一步生物信息学分析及文献挖掘,探讨SUSD2可能的作用途径及作用机制。研究结果1、NSCLC相关基因的筛选及生物信息学分析利用QOE软件筛选出共同差异表达基因285个,其中上调表达基因99个,下调表达基因186个。运用DAVID等生物信息学工具对这些差异基因进行功能注释和通路分析,发现这些基因主要与细胞周期、细胞粘附、细胞复制、p53信号通路等生物通路相关。采用iHOP软件对差异基因进行文献挖掘,首次发现S USD2基因可能与NSCLC有关。进一步分析SUSD2蛋白质结构,结果显示SU SD2蛋白质结构包括4部分:Somatomedin B结构域;AMOP;von Willebrand factoe,type D结构域(vWD);Sushi/SCR/CCP结构域。根据该结构预测蛋白质功能,发现SUSD2可能与细胞粘附、迁移、补体激活、蛋白质水解等生物学功能有关,为进一步功能实验奠定理论基础。2、SUSD2基因在NSCLC细胞系和临床样本中的表达水平分析1)利用 q-PCR 及 WB 检测 NSCLC 细胞系(A549,H322,SPC-Al,GLC-82)和人支气管上皮细胞16HBE中SUSD2的表达量,结果显示:4个非小细胞肺癌细胞系中SUSD2表达量均低于人支气管上皮细胞16HBE表达量,其中A549表达最高,H322表达量最低。2)利用q-PCR和WB检测24例接受肺癌切除手术的NSCLC患者标本以及对应癌旁组织肺标本中SUSD2的表达情况,q-PCR结果显示:24例临床样本中,20例癌组织呈SUSD2低表达。以肺癌组织样本中和相对应的癌旁组织2组的-△Ct进行配对样本t检验,差异具有显著意义(t=-5.062,P=0.000)。W B结果显示24例临床样本中,21例癌组织呈低表达。以肺癌组织样本和相对应的癌旁组织2组的灰度值进行配对样本t检验,差异具有显著意义(t=-6.733,P=0.000)。3)利用免疫组化检测SUSD2在160例非小细胞肺癌及32例正常肺组织中的表达水平,结果显示:SUSD2在部分肿瘤组织样品中低表达(72/160),而在正常样品中呈高表达(32/32),两者具有统计学差异(P=0.000)。进一步分析S USD2表达量与临床病理特征的关系结果表明:SUSD2的表达量与病理分级(X2=37.982,P=0.000),临床分期(X2= 4.818,P= 0.028)和淋巴结转移(X2= 14.268,P = 0.000)相关,而在其他的临床病理特征包括性别(X2=0.786,P=0.375),年龄(X2=0.265,P=0.607),病理类型(X2=0.363,P=0.057)、pT(X2=1.326,P=0.250)和远处转移(P=0.207)无显著差异。3、SUSD2对NSCLC细胞株的生物学影响1)成功构建了 SUSD2过表达载体pcDNA3.1-SUSD2及三个干扰载体shR NA1、shRNA2、shRNA3,并筛选到最佳干扰载体shRNA-2(命名为psi-mHl-SU SD2),该载体可使SUSD2 mRNA水平的相对表达量下调75%以上。2)成功筛选出阳性稳定转染重组质粒pcDNA3.1-SUSD2的H322细胞株和阳性稳定转染重组质粒psi-mHl-SUSD2的A549细胞株。3)平板克隆形成实验及CCK-8检测细胞增殖情况。平板克隆形成实验结果显示:在过表达组,SUSD2(+)组细胞克隆数为47.670±6.028,Vector组细胞克隆数为99.000±16.823,提示SUSD2表达水平增高可以显著抑制H322细胞的集落形成(t=-4.976,P=0.008);在干扰组,SUSD2(-)细胞克隆数为 100.670±23.245,shRNA-scramble细胞克隆数为39.670±10.263,提示SUSD2表达水平降低可以显著促进A549细胞的集落形成(t=4.158,P=0.014)。CCK-8实验结果显示:提高 SUSD2 的表达水平在 24(t=-19.964,P=0.000),48(t=-16.745,P=0.000)和 72(t=-14.370,P=0.000)小时能够对H322细胞的增殖产生显著的抑制作用;降低SU SD2 的表达水平在 24(t=5.296,P=0.001),48(t=9.018,P=0.000)和 72(t=7.037,P=0.000)小时能够对A549细胞的增殖产生显著的促进作用。4)平板粘附实验检测细胞粘附能力。MTT比色结果显示:在过表达组,S USD2(+)组细胞 OD 值为 0.223±0.020,与 Vector 组 OD 值 0.424±0.025 相比,两组细胞粘附能力的差异具有统计学意义(t=-14.228,P=0.000),提示提高SUSD2的表达量能特异地抑制H322细胞的粘附能力;在干扰组,SUSD2(-)组细胞OD值为0.547±0.011,与siRNA-sramble组OD值0.337±0.036相比,两组细胞粘附能力的差异具有统计学意义(t=12.572,P=0.000),提示降低SUSD2的表达量能特异地增强A549细胞的粘附能力。5)Transwell小室法检测细胞侵袭能力,结果显示:在过表达组,SUSD2(+)组细胞穿膜细胞数为11.670±3.055,Vector组细胞穿膜细胞数为30.000±5.568,提示上调H322细胞中SUSD2的表达能显著抑制H322细胞的侵袭能力(t=-5.000,P=0.007);在干扰组,SUSD2(-)组细胞穿膜细胞数为48.330±8.145,Vector组细胞穿膜细胞数为24.330±8.505,提示下调细胞中SUSD2的表达能显著增强A549细胞的侵袭能力(t=3.530,P=0.024)。6)流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡。细胞周期结果显示,SUSD2表达量的改变均未引起显著的细胞周期的变化(P>O.O5)。细胞凋亡结果显示过表达SUSD2可显著促进H322细胞的晚期凋亡率[SUSD2(+)vs Vector:11.003±1.584 vs 6.920±1.765,t=2.982,P=0.041]和总凋亡率[SUSD2(+)vs Vector:14.913± 1.227 vs 8.020±0.809,t=8.126,P=0.001];下调表达 SUSD2 可抑制 A549 细胞的早期凋亡[SUSD2(-)vs shRNA-scramble:1.757±1.685 vs 6.810±1.810,t=-3.537,P=0.024]、晚期凋亡[SUSD2(-)vs shRNA-scramble:10.340±1.492 vs 14.003±1.611,t=-2.890,P=0.045]、总凋亡率[SUSD2(-)vs shRNA-scramble:12.097±2.831 vs 20.810±3.414,t=-3.402,P=0.027]。4、对过表达组和干扰组的基因芯片表达谱检测。对每一组差异倍数在1.5倍以上的基因进行了上下调频数的统计:在过表达组,上调基因为3392个,下调基因为2883个;在干扰组,上调基因为1097个,下调基因为893个。GO富集结果显示:在过表达组,差异表达基因参与的主要生物学过程包括:信号转导、依赖DNA的调节转录、多细胞有机体发育、生物过程、细胞周期等;分子功能主要包括蛋白粘连、核苷酸结合、金属离子结合、ATP结合等;在干扰组,差异表达基因参与的主要生物学过程有:信号转导、依赖DNA的调节转录、多细胞有机体发育、细胞粘附、生物过程等;分子功能主要包括蛋白粘连、金属离子结合、核苷酸结合、ATP结合等;KEGG分析结果显示:在过表达组,差异基因主要分布在代谢途径、肿瘤通路、MAPK信号通路、内吞作用等;在干扰组,差异基因主要分布在代谢途径、MAPK信号通路、肿瘤通路、细胞粘附、钙离子信号通路等。利用STRING进行差异基因编码蛋白的相互作用分析,结果显示:在过表达组,NSCLC相关基因编码蛋白主要集中在EGFR、HSP90AA1、AKT2、NOTCH、PIK3CD、MAPK4、CXCR4等。在干扰组,NSCLC相关基因编码蛋白主要集中在EGFR、IL6、JUN、AKT2、PHLPP1、HDACP、CDC6等。进一步在基因芯片结果中分析这些基因的表达量改变趋势,发现其中EGFR、AKT2、CXCR4、HDAC9等基因在过表达组与干扰组均有变化,而且趋势相反,提示这些基因的表达量变化可能与SUSD2相关。文献挖掘发现这些基因都已经被证实在NSCLC发生发展中起着重要的作用。结论利用基因芯片表达谱数据分析工具、生物信息学工具及文献挖掘工具对NSCLC相关差异基因进行了深入的生物信息学分析筛选到新的NSCLC相关基因SUSD2。NSCLC细胞系和临床样本中对SUSD2基因的表达水平分析验证了SUSD2在NSCLC中呈低表达模式;体外细胞生物学证实了 SUSD2基因具有抑制NSCLC细胞的生长、增殖、粘附和侵袭能力,同时可以促进细胞凋亡;利用基因表达谱芯片检测上调和下调SUSD2表达引起的基因差异,进一步生物信息学分析及文献挖掘结果提示:重要差异基因EGFR、AKT2、CXCR4、HDAC9跟NSCLC的发生发展相关,提示SUSD2可能通过跟这些基因相互作用发挥着抑癌作用,为SUSD2在NSCLC中的信号通路及作用机制研究奠定基础。