水稻矮化少分蘖基因D26的图位克隆及功能研究

来源 :华侨大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:jinhait2009
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作为重要的粮食作物,水稻从传统的经验育种向现代精准育种转变的过程中,株型是影响水稻产量最为重要因素之一,它取决于植株高度、分蘖数目、分蘖角度、穗形态等因素。对于水稻株型的机制研究,是短期内难以突破的科学问题和技术难题,其中矮化突变体是非常理想的研究对象,但是调控机制知之甚少。本文在前期研究的工作基础上,对水稻矮化、少分蘖D26突变体进行系统研究,揭示它参与水稻油菜素内酯激素调控的信号通路机制。本文从水稻突变体库中组织培养变异获得了2个农艺性状表现矮化、少分蘖的突变材料D26-1和D26-2,通过图位克隆实现精细定位和进一步的功能分析,揭示了D26突变体矮化表型的遗传机理,并从互作蛋白筛选和转录组测序分析角度,进一步挖掘水稻矮化机制。主要结果如下:D26突变体一个隐性单基因控制表型。利用D26突变体做母本和93-11亲本做父本,构建杂交F2群体,通过425个群体和531个群体将其分别定位在3号染色体短臂上63 kb区间,该区间内包含12个候选基因;分析预测和克隆、测序表明D26基因是一个编码GRAS家族蛋白的转录因子,两个突变体在D26基因540 bp和560 bp处各缺失一个碱基C造成基因提前终止;另将野生型D26基因转入D26突变体中获得突变表型恢复。此外,D26突变体直立表型和特异地表现第二节间缩短,推测表明D26基因可能参与了油菜素内酯(BR)的信号通路;进一步的BR激素不敏感性实验表明,D26突变体是一个对外源BR不敏感表型的矮化突变体。水稻原生质体亚细胞定位结果表明,D26表达分布于整个细胞。通路基因相对定量分析表明D26基因不仅参与BR应答机制,而且是一个水稻BR激素信号通路中的正向调控因子。D26突变体中一个重要的产量性状控制表型是调控水稻粒型,为了进一步了解掌握D26基因调控水稻粒型机制,我们分别设计了D26基因的过量表达和基因敲除实验。结果表明,在D26基因过量表达的株系中,谷籽的变化与基因的表达成正比,表达量越高,谷籽越长、越细;在D26基因基因敲除中,谷籽反而变宽、变短。正、反向遗传学研究数据表明,D26基因是通过BR正向响应调节水稻籽粒发育。种子颖壳的电镜扫描观察结果表明,D26基因表达水平直接影响水稻颖壳表皮细胞分裂程度,从而调节了水稻粒型形态。结合生物信息学预测和GST pull-down技术筛选互作蛋白的结果表明,D26蛋白作为GRAS家族的一个转录因子,它的互作蛋白主要是与水稻锌指蛋白家族成员相关,初步推测D26蛋白可能是通过与水稻锌指蛋白一起互作后参与到油菜素内酯BR通路调控。转录组GO富集数据挖掘分析,表明差异基因变化主要集中在分子功能和生物学过程方面表达的基因差异显著,而对细胞组分方面的基因影响不显著。其中,外源BR处理突变体的样本,与野生型相比,差异基因的总数是增加的,但与突变体相比,差异基因显著性变化的基因主要是下调表达,上调表达的差异显著的基因仅有15个。KEGG通路富集的数据表明,D26突变体主要引起3条通路的表达显著变化,一方面影响牛磺酸和低钙氨酸代谢和糖酵解/糖异生代谢通路基因差异表达,另一方面主要影响二萜类生物合成通路,该通路对应的是赤霉素生物合成,其GA生物合成上游基因表达发生调节。突变体与野生型相比,GA生物合成上游中有4个基因发生了上调,促进了GA的生物合成代谢通路;而BR外源激素处理过的突变体与突变体本身相比,GA生物合成上游有5个基因发生了下调,抑制了GA的生物合成代谢通路。综上所述,本项研究以2个矮化、少分蘖D26突变体为材料,阐明了其参与水稻油菜素内酯(BR)信号通路和正向调节水稻粒型的机制,pull down蛋白互作的结果表明D26蛋白在体内不是独立起作用的,很有可能与水稻锌指蛋白一起共同作用。转录组测序KEGG富集通路获得了水稻中外源与内源的油菜素内酯(BR)和赤霉素之间相互作用的关系,表现为外源的BR抑制了GA的生物合成代谢通路。所有这些拓宽了对D26蛋白功能的认识,有效补充了油素内酯激素在水稻中的调控机制,为下一步的应用研究奠定了一定的理论基础。
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