通常情况下,人体在接种流感疫苗一段时间之后仍有可能再次感染流感病毒,机体对于流感病毒似乎并不能形成有效的记忆,以致每年都需要接种流感疫苗。已知持久的免疫保护效应主要来自于特异性抗体和免疫记忆的产生,但是什么因素限制了流感疫苗的效果和维持还不是很清楚。本研究主要目的在于探讨人NK细胞在接种流感疫苗后是否能形成记忆,以及记忆性NK细胞形成的相关机制和功能发挥。我们以接种季节性流感疫苗志愿者为研究对象,分离接种前后约6个月的外周血单个核细胞,检测T细胞、自然杀伤细胞和抗体的动态应答,利用和疫苗成分相同或不同的流感病毒体外模拟二次刺激,研究NK细胞的记忆应答。我们发现流感疫苗接种后能够诱导潜在的记忆性NK细胞,疫苗免疫后最初的六个月内检测到NK细胞抗原特异性的IFN-γ应答增强,这种IFN-γ应答可以被anti-NKp46抗体阻断,而且可能和NK细胞表面NKp46受体的内化有关,但是这种NKp46的动态变化只能维持6个月。因此,胞内NKp46的表达可能提示一种记忆性NK细胞形成的条件以及疫苗发挥效应的限制因素。进一步研究发现,病毒血凝素HA和细胞表面受体NKp46的相互作用中,IL-2信号可以放大二次应答效应。我们获得的结果主要有以下几点：(1)体液免疫方面,流感病毒的保护作用可以通过血凝素抗体表征。动态检测流感疫苗接种后血浆HA抗体滴度,发现抗体应答具有一定的局限。通过血凝抑制HI实验,我们仅检测到包含在疫苗成分中的流感病毒,如A/California/7/2009(H1N1)株HA抗体的升高,如果是不包含在疫苗成分中的流感病毒如A/PR8株,HA抗体滴度则始终没有提高。由于流感病毒变异快,容易发生抗原漂移或转变,所以抗体能针对同种异型的流感病毒的保护作用有限。(2)分离接种疫苗前后志愿者外周血,体外用同型或异型的流感病毒模拟二次刺激检测NK细胞的效应功能。我们发现外周NK细胞,而非CD3+T细胞,能够产生持久的IFN-y记忆样应答。而且NK细胞能对多种不同亚型的流感病毒(包括H1N1、H3N2、B型)产生记忆样应答,提示NK细胞记忆样应答具有泛特异性,也即能针对多种不同流感病毒亚型提供广泛的免疫记忆,从而促进流感疫苗的交叉保护。(3)流式细胞术对外周血NK细胞表面一系列分子的动态检测发现,CD3-CD56dimNK细胞表面NKp46在疫苗接种一个月后发生下调,3个月时下调程度最高,但随后恢复表达,到6个月时NKp46的表达水平又接近接种前水平。下调的NKp46主要发生在CD56dim NK细胞上,CD56dim NK细胞表达NKp46水平没有变化。未接种组NKp46始终稳定表达。除了NKp46之外,我们也检测了其他记忆性相关的分子标志,包括CD45RO, CD45RA, NKp44, CD57, NKG2C, CXCR6,CD27和CD62L,我们发现这些分子在接种组和未接种组中半年内表达水平都保持相对稳定。进一步分析发现,NKp46的表达降低伴随抗原再刺激IFN-γ应答升高,两者有一定的负相关。(4)我们发现NK细胞表面NKp46的下调和受体的内化有关。对接种疫苗的志愿者外周血NK细胞长期的检测发现,在表面NKp46表达下调的同时,NK细胞胞内NKp46表达明显上调。接种疫苗前,CD56dimNK胞内几乎不表达NKp46,对A/PR8的刺激也没有IFN-γ应答；疫苗接种一个月后,CD56dim NK细胞胞内NKp46表达增多,在3个月时达到最高,6个月后逐渐恢复到接种前水平,这种动态变化和二次应答产生IFN-y的动力学一致。因此,CD56dim NK细胞胞内NKp46的动态变化和二次应答产生IFN-y的能力正相关,提示胞内NKp46的出现可能是促成NK细胞发生功能转换,从而对病毒的二次刺激产生更强的效应功能。(5)在体外二次刺激中,NK细胞上调的IFN-y记忆样应答能够通过anti-NKp46抗体阻断,说明存在NKp46和HA的相互作用。在体外用流感疫苗FluaRIX刺激PBMCs或者纯化的NK细胞,同时加入IL-2中和抗体,我们发现加入IL-2中和抗体之后并没有抑制纯化NK细胞体系产生IFN-γ二次应答,但PBMCs体系中的NK细胞再刺激之后能分泌IL-2并且有更高的IFN-γ应答。总的来说,我们发现NK细胞的IFN-γ应答是依赖于NKp46受体的记忆样应答,IL-2信号可以协同HA-NKp46之间的相互作用从而放大二次应答效应。流感疫苗的NK细胞记忆性是“有限的”,流感疫苗诱导潜在的记忆性NK细胞大概维持6个月,但是否和目前流感疫苗无法提供持久有效的保护有关还需进一步研究。综上所述,我们首次发现人NK细胞具有记忆性应答的特征,为了解记忆性NK细胞形成的分子机制以及疫苗的免疫效果提供新的信息,对将来研究持久、通用型的疫苗提供思路。