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目的:甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,近年来发病率逐年增高,目前已高居我国恶性肿瘤的第7位。甲状腺癌中约95%以上的病理类型为分化型甲状腺癌（differentiated thyroid cancer,DTC）,而DTC中最常见的病理亚型为甲状腺乳头状癌（papillary thyroid cancer,PTC）,大部分PTC患者经过规范的治疗后预后较好,但仍有约15%的患者术后出现复发、转移和碘抵抗等,使生存率明显降低。因此,迫切需要进一步明确PTC发生发展的分子机制。RNA甲基化修饰是高等真核生物的RNA中最普遍的化学修饰,主要包括m6A、m5C、m1A等,其中N6-甲基腺嘌呤（m6A）最常见,它主要通过甲基化修饰酶（Writer）、去甲基化修饰酶（Eraser）和m6A结合蛋白（Reader）动态可逆地调控RNA生命周期的所有阶段。越来越多的证据支持m6A与乳腺癌、肠癌、白血病等多种肿瘤的发生发展密切相关,而m6A修饰在PTC中是否可以发挥生物学功能目前尚不明确。本文旨在研究RNA m6A修饰在PTC中的作用,寻找发挥关键作用的m6A修饰酶,并明确此关键酶对PTC生物学行为的影响及其作用机制。方法:首先,我们利用RNA m6A水平定量试剂盒检测5对PTC组织和配对的癌旁组织中m6A的整体水平,并通过q RT-PCR检测30对PTC组织和配对的癌旁组织中m6A修饰酶的表达情况,进而筛选出PTC中m6A修饰的关键酶。在明确去甲基化酶FTO是PTC中m6A修饰的关键酶后,我们将组织样本量扩大至100对,利用q RT-PCR进一步验证了FTO mRNA在PTC组织和配对的癌旁组织中的表达情况,并分析其与临床病理资料的联系,随后又通过western blot和免疫组化检测了20对PTC组织和配对的癌旁组织中FTO的蛋白表达情况。其次,我们通过western blot检测FTO在正常甲状腺细胞系Nthy-ori3-1和四种PTC细胞系中的蛋白表达情况,选取FTO的蛋白表达明显低于Nthy-ori3-1细胞的PTC细胞系进行实验。随后,我们分别利用si-RNA下调FTO的表达和慢病毒过表达FTO,并构建了将m6A结构域突变的过表达FTO-mut细胞系,通过q RT-PCR和western blot确定干扰和过表达效率;然后,利用CCK8实验和平板克隆实验检测FTO对PTC细胞增殖能力的影响,并通过裸鼠荷瘤实验检测FTO对PTC异种移植瘤生长的影响。利用Seahorse实验、葡萄糖定量和乳酸定量试剂盒检测FTO对PTC糖酵解代谢的影响,并通过western blot检测FTO对糖酵解代谢相关蛋白表达的影响,18F-FDG micro PET显像检测FTO对PTC异种移植瘤葡萄糖摄取的影响。最后,通过MeRIP-seq和mRNA-seq筛选FTO下游发生m6A修饰的靶基因,q RT-PCR和western blot检测FTO对靶基因APOE的mRNA和蛋白表达的影响,随后利用DAA抑制剂、MeRIP-qPCR和双荧光素酶报告基因验证FTO对APOE的m6A修饰作用。利用q RT-PCR检测下调IGF2BP家族对APOE表达的影响,RNA稳定性实验检测下调FTO和IGF2BP2对APOE mRNA稳定性的影响。随后通过q RT-PCR和免疫组化检测APOE在PTC组织和配对的癌旁组织中的表达情况,分析其与临床病理资料的联系以及与FTO在PTC中表达的相关性,通过体内外实验检测APOE对PTC细胞增殖能力和糖酵解代谢的影响。此外,我们还利用GSEA分析了FTO和APOE下游共同相关的信号通路,并通过western blot检测信号通路相关蛋白的表达。结果:我们发现PTC中RNA m6A的整体水平上调,去甲基化酶FTO mRNA在PTC组织中表达显著下调,与腺外侵袭和淋巴结转移呈显著负相关,且FTO在PTC中的蛋白表达同样下调。FTO在TPC1和K1细胞中的表达明显低于正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1,因此,我们选取这两种细胞系进行实验。si-FTO可明显下调FTO的表达,并使PTC细胞中m6A的整体水平升高,下调FTO可促进K1和TPC1细胞的增殖,体内实验发现下调FTO可促进PTC皮下移植瘤的生长;过表达FTO会使PTC细胞中m6A的整体水平下降,并抑制PTC细胞的增殖,体内实验发现过表达FTO可抑制PTC皮下移植瘤的生长,而过表达FTO-mut组对PTC的m6A整体水平和增殖无影响。此外,下调FTO可促进PTC细胞的糖酵解代谢,抑制其线粒体氧化磷酸化,同时会使PTC细胞的葡萄糖消耗和乳酸产生增多,并促进糖酵解相关蛋白GLUT1、HK2和LDHA的表达;过表达FTO可抑制PTC细胞的糖酵解代谢,但过表达FTO-mut组对PTC的糖酵解代谢无影响。而糖酵解抑制剂2-DG可抑制下调FTO促进的细胞增殖,说明FTO是通过糖酵解代谢来影响细胞增殖的。18F-FDG micro PET显像发现FTO可抑制裸鼠PTC异种移植瘤的葡萄糖摄取。联合分析MeRIP-seq和RNA-seq数据确定FTO下游发生m6A修饰的靶基因APOE,下调FTO会促进APOE的表达,过表达FTO会抑制其表达;甲基化水平抑制剂DAA可抑制下调FTO引起的APOE表达上调,MeRIP-qPCR发现m6A抗体可以富集到发生m6A修饰的APOE,下调FTO后富集程度明显增加,双荧光素酶报告基因检测发现下调FTO可使野生型APOE的荧光素酶活性增加,而对突变型APOE的荧光素酶活性无影响。随后,我们发现下调FTO能增加APOE mRNA的稳定性促进其表达,而下调IGF2BP2会通过降低APOE mRNA的稳定性抑制其表达,同时下调FTO后会增加IGF2BP2与APOE mRNA的结合。q RT-PCR和免疫组化发现APOE在PTC组织中表达显著上调,并与直径≥2cm和腺外侵袭呈显著正相关,PTC中APOE和FTO的表达呈显著负相关。下调APOE会抑制PTC细胞的增殖、糖酵解代谢及GLUT1蛋白的表达,2-DG同样也可抑制过表达APOE引起的细胞增殖,说明APOE也是通过糖酵解代谢影响细胞增殖的。共转染si-FTO和si-APOE进行挽救实验发现下调APOE可显著降低si-FTO促进的增殖、糖酵解代谢、葡萄糖消耗和乳酸产生,体内实验发现下调APOE可显著抑制sh-FTO促进的肿瘤生长和葡萄糖摄取。最后,GSEA分析发现FTO和APOE均与下游IL-6/JAK/STAT3信号通路高度富集,下调FTO会促进p JAK2和p STAT3蛋白的表达,下调APOE可抑制p JAK2和p STAT3蛋白的表达。结论:RNA m6A的整体水平在PTC中上调,去甲基酶FTO的表达显著下调,FTO通过IGF2BP2介导的m6A修饰抑制APOE的表达,并可能通过IL-6/JAK2/STAT3信号通路抑制PTC的糖酵解代谢,进而影响其增殖。