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目的胃癌(gastric cancer,GC)是世界第4大常见恶性肿瘤,居全球癌症相关死因第2位,其5年总体生存率约25%。由于缺乏理想的早期胃癌诊断标志物,80%患者被诊断时已处于疾病进展期,多数胃癌患者的预后受到了极大限制。同时,由于胃癌病理生理机制的不清又进一步影响其临床治疗效果。因此,揭示胃癌的分子特征、更好地理解胃癌发病机制是当前胃癌研究的重点所在。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸(nuclotide,nt),具备多种生物学功能,涉及生理到病生一系列过程的非编码RNA分子。它们可在表观遗传、转录以及转录后等多个水平广泛参与基因表达的调控,影响肿瘤的发生和发展,与肿瘤侵袭、转移及患者预后密切相关。然而,lncRNA与胃癌的关系目前仍所知甚少。所以发现并鉴定胃癌相关lncRNA分子对于胃癌诊治将有重要意义。因此,本研究的首要目的是探索lncRNA参与胃癌发生的分子机制,同时明确lncRNA作为肿瘤标志物用于胃癌筛查和患者预后评估的临床价值。方法1.在lncRNA芯片筛选胃癌组织和配对癌旁组织中差异表达lncRNA的基础上,采用荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测lncRNA线粒体RNA处理核糖核酸内切酶RNA组份(RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease,RMRP)在胃癌组织及其配对癌旁组织、正常胃黏膜上皮细胞株(GES-1)和5株胃癌细胞株(AGS,BGC-823,HGC-27,MGC-803和SGC-7901)中的表达水平差异。2.qrt-pcr分析rmrp在健康人胃黏膜组织、良性病变胃黏膜(溃疡和胃炎)、异型增生胃黏膜和各期胃癌组织中的表达规律。3.克隆测序技术证明血浆、胃液rmrp和gapdhmrna的存在性,反复冻融试验和不同时间和温度放置试验确定体液rmrp的稳定性,细胞上清试验探究体液rmrp来源。4.建立血浆和胃液lncrna检测方法,分析血浆和胃液rmrp在胃癌发生各阶段的变化规律;分析胃癌组织、血浆和胃液rmrp水平与患者临床病理因素之间的关系;构建受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic,roc)曲线,确定血浆、胃液rmrp诊断价值。5.mircode软件预测与rmrp相互作用的mirna分子。6.设计并合成针对rmrp的小干扰rna(smallinterferingrna,sirna)和rmrp的pcdna3.1表达载体,转染正常胃黏膜上皮细胞株和胃癌细胞株,qrt-pcr检测rmrp和细胞周期蛋白d2(cyclind2)的水平变化;沉默或上调细胞rmrp表达水平后,分别采用流式细胞仪(flowcytometer)、实时细胞分析仪(real-timecellanalyzer,rtca)和平板克隆形成试验(platecolonyformationassay)检测细胞周期、凋亡和增殖的变化。7.建立裸鼠胃癌移植瘤模型,体内实验验证rmrp的生物功能,分析血浆rmrp水平变化规律。结果1.与癌旁组织相比,rmrp在68.2%(90/132)胃癌组织中表达水平显著降低;相对于正常胃黏膜上皮细胞株(ges-1),5株胃癌细胞株(ags,bgc-823,hgc-27,mgc-803和sgc-7901)中的rmrp表达水平显著改变。2.qrt-pcr结果显示,rmrp表达水平只在胃癌前病变组织(异型增生)和胃癌组织中显著降低,在胃良性病变(胃溃疡和胃炎)组织中没有明显改变,显示出良好的胃癌相关性。3.克隆测序技术证明血浆、胃液中存在rmrp。血浆和胃液gapdhmrna水平恒定,是采用qrt-pcr方法检测体液lncrna水平的理想参照。4.冻融试验和不同时间、温度放置试验结果显示血浆和胃液rmrp水平基本不变,体液rmrp的稳定性可满足临床常规分析要求。细胞上清试验显示体液rmrp来源于细胞主动分泌。5.相对健康人群,血浆RMRP水平在胃癌患者群体中显著升高,胃癌术后随着肿瘤组织的切除明显回落;胃癌患者组的胃液RMRP水平显著升高。血浆和胃液RMRP作为胃癌筛查标志物具有较高的敏感性和特异性,优于传统肿瘤标志物。联合检测胃液RMRP、胃液CEA和血清CEA更可提高胃癌检出率。6.胃癌组织RMRP的表达水平与Borrmann分型(P=0.002)、侵袭程度(P=0.037)、淋巴结转移(P=0.014)、周围神经侵袭(P=0.008)以及组织CEA(P<0.001)和CA19-9(P=0.003)表达情况密切相关。胃癌患者术前血浆RMRP水平与胃癌直径大小(P=0.031)、胃癌分期(P=0.038)、侵袭程度(P=0.017)和组织CEA表达情况(P=0.032)正相关,而术后2 w血浆RMRP回落程度与淋巴结转移(P=0.040)和组织CEA表达情况(P=0.049)密切相关。7.细胞实验和动物实验证明沉默RMRP表达能显著抑制肿瘤增殖,而上调RMRP表达则能促进细胞增殖和肿瘤生长。8.沉默细胞RMRP表达能使细胞周期显著阻滞于G0/G1期;相反,上调细胞RMRP表达水平后,能促进细胞周期从G0/G1期过渡到S期。进一步研究发现,RMRP可充当miR-206海绵,通过调控下游靶基因Cyclin D2表达发挥其细胞周期调控效应。结论经体内和体外机制研究,从正反两方面证明RMRP在胃癌的发生和发展中发挥着重要作用。大样本临床标本分析显示,RMRP是胃癌筛查和患者预后评估的潜在标志物。