研究目的:2型糖尿病（T2DM）是一种以胰岛β细胞质量进行性衰竭伴随糖代谢紊乱进行性加重为主要病理生理特征的代谢性疾病。目前T2DM患病率在逐年升高,已成为全球重大公共卫生负担。尽管研究者们一直致力于胰岛β细胞损伤和恢复的相关机制研究,但迄今为止,关于胰岛β细胞数量减少和功能障碍的全面而明确的机制尚不清楚。目前普遍认为氧化应激、内质网应激、炎性反应等因素是长期持续高血糖诱导胰岛β细胞质量恶化的主要原因,然而,针对这些损伤因素尚缺乏更深入的研究以阐明加速胰岛β细胞衰竭具体而明确的机制。因此,本实验想要深入探究糖毒性对胰岛β细胞损伤的作用机制。波动性高糖是糖尿病患者体内除持续性高糖外存在的另一种重要的葡萄糖代谢紊乱形式。相比于持续高糖,目前关于波动高糖对细胞损伤作用及机制的相关报道相对甚少,尽管如此,仅有的研究也已证实波动高糖对组织细胞的损伤作用比持续高糖更为强烈。在T2DM发病过程中,血糖波动不仅存在并加速病程进展,同时也加剧相关并发症的发生发展。然而到目前为止,血糖波动对胰岛β细胞损伤的具体机制尚不完全清楚,故本实验旨在针对波动高糖对胰岛β细胞的损伤作用及其机制进行探究。波动高糖条件下ROS大量生成介导的氧化应激被认为是波动高糖损伤作用的重要机制。ROS的主要细胞内来源是线粒体,然而当ROS过量产生时,线粒体也是ROS攻击的主要靶点,触发线粒体功能障碍。此时,机体能通过线粒体自噬机制及时对异常线粒体进行靶向清除,促进线粒体功能的恢复。在以往的研究中线粒体自噬被认为在细胞应激状态下发挥保护作用,然而新近研究发现ROS介导的线粒体自噬还可能是加剧损伤的重要因素,其原因可能与ROS含量有关。鉴于目前关于波动高糖是否影响了胰岛β细胞中线粒体自噬水平以及生理意义如何尚未有报道,故本实验将对波动高糖条件下,胰岛β细胞中线粒体自噬活性进行探讨并阐明其病理生理意义。目前已发现PI3K/Akt、ERK、p38 MAPK等多种信号途径参与氧化应激损伤的分子机制。PI3K/Akt是细胞内经典的信号通路之一,PI3K活化后产生的PIP3可激活Akt进而启动下游效应物的磷酸化级联反应,参与调节细胞代谢、增殖、存活等多种生物学过程。mTOR是PI3K/Akt信号通路重要下游因子,mTOR作为自噬/线粒体自噬的负调节因子被人们所熟知。另外,据报道PI3K/Akt/mTOR通路是参与T2DM发生发展的重要分子机制。因此,我们推测波动高糖可能通过PI3K/Akt/mTOR通路调控线粒体自噬,从而影响胰岛β细胞功能与活性。综上,本研究将在体内和体外模拟波动高糖和持续高糖两种高糖模式来探讨糖毒性对胰岛组织病理生理的影响,并深入探讨波动高糖是否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节线粒体自噬从而影响胰岛β细胞功能及其与持续高糖之间是否存在差异性,以期为延缓T2DM病程进展奠定新的分子学理论基础。研究方法:第一部分:波动性高糖对大鼠胰腺组织和INS-1细胞功能的影响SD雄性大鼠随机分为3组:正常对照组（NC组）、持续高血糖T2DM组（SHG组）、波动高血糖T2DM组（IHG组）,IHG组血糖波动干预6周后,各组大鼠行口服葡萄糖耐量（OGTT）和胰岛素释放试验。留取胰腺组织,免疫组化法检测胰岛素表达,HE、PAS染色分析胰岛形态结构改变和糖原沉积情况。INS-1细胞分组培养:正常糖对照组（NG组）、持续高渗透压对照组（SHM组）、波动高渗透压对照组（IHM组）、持续性高糖组（SHG组）、波动性高糖组（IHG组）,24h后活性氧（ROS）试剂盒检测ROS含量,ELISA试剂盒检测胰岛素分泌水平,流式双染法检测细胞凋亡率。第二部分:线粒体自噬在波动性高糖影响胰岛β细胞功能中的作用SD雄性大鼠随机分为3组:NC组、SHG组、IHG组,IHG组血糖波动干预6周后留取各组大鼠胰腺组织,双免疫荧光法检测自噬蛋白LC3与LAMP2的共定位表达,Western blot和免疫组化法检测自噬蛋白Beclin1以及线粒体蛋白Tom20、HSP60的蛋白表达。INS-1细胞分组培养:NG组、SHG组、IHG组,24h后应用透射电镜观察自噬体、线粒体自噬体及自噬溶酶体的形成,双免疫荧光法检测自噬蛋白LC3与LAMP2的共定位表达,Western blot和real-time PCR分别检测自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1及线粒体蛋白Tom20、HSP60的蛋白和m RNA表达。INS-1细胞分组培养:NG组、Mdivi-1（线粒体自噬抑制剂）组（NGM组）、IHG组、IHG+Mdivi-1组（IGM组）,24h后ROS试剂盒检测ROS含量,ELISA试剂盒检测胰岛素分泌水平,流式双染法检测细胞凋亡率。第三部分:PI3K/Akt/mTOR通路在波动性高糖影响INS-1细胞线粒体自噬中的作用INS-1细胞分组培养:NG组、SHM组、SHG组、IHM组、IHG组、IHG+LY294002（PI3K抑制剂）组（IPI组）,24h后Western blot检测p-Akt/t-Akt、LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ、Tom20、HSP60蛋白表达。INS-1细胞分别在正常糖条件和波动性高糖条件下分组培养:NG组、SC79（Akt激活剂）组（NAA组）、MHY1485（mTOR激活剂）组（NMA组）、IHG组、IHG+SC79组（IAA组）、IHG+MHY1485组（IMA组）,24h后Western blot检测p-Akt/t-Akt、p-mTOR/t-mTOR、LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ、Tom20、HSP60蛋白表达,real-time PCR检测Beclin1、Tom20、HSP60 m RNA表达,ROS试剂盒检测ROS含量,ELISA试剂盒检测胰岛素分泌水平,流式双染法检测细胞凋亡率。实验结果:第一部分:波动性高糖对大鼠胰腺组织和INS-1细胞功能的影响1.血糖波动T2DM大鼠模型（1）糖尿病组大鼠血糖升高,胰岛素分泌水平降低;且IHG组较SHG组改变更显著。（2）NC组大鼠胰岛中遍布胰岛素染色阳性细胞,SHG组和IHG组染色阳性细胞减少,且IHG组较SHG组更显著。（3）NC组大鼠胰岛体积充盈,结构清晰,形态呈岛屿状,胰岛β细胞均匀分布于胰岛中;SHG组大鼠胰岛萎缩,边缘欠规则,胰岛β细胞数目减少;IHG组大鼠胰岛明显萎缩,结构模糊,胰岛β细胞数目显著减少。（4）糖尿病组大鼠胰岛中糖原沉积增加,IHG组较SHG组更显著。2.波动性高糖INS-1细胞模型（1）与NG组相比,SHG组和IHG组胰岛素分泌减少,ROS水平和细胞凋亡率增加;IHG组较SHG组改变更显著;SHM组和IHM组无明显差异。第二部分:线粒体自噬在波动性高糖影响胰岛β细胞功能中的作用1.血糖波动T2DM大鼠模型（1）与NC组相比,SHG组和IHG组LC3与LAMP2共定位增多,Beclin1蛋白表达增加,Tom20、HSP60蛋白表达减少;IHG组较SHG组改变更显著。2.波动性高糖INS-1细胞模型（1）与NG组相比,SHG组和IHG组自噬体、线粒体自噬体、自噬溶酶体的数目增多;LC3与LAMP2共定位增多;LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达增加,Beclin1 m RNA表达增加,Tom20、HSP60蛋白和m RNA表达均减少;上述改变IHG组较SHG组更显著。（2）与NG组相比,IHG组胰岛素分泌减少,ROS含量和细胞凋亡率增加;与IHG组相比,IGM组胰岛素分泌水平增高,ROS含量和细胞凋亡率降低。第三部分:PI3K/Akt/mTOR信号通路在波动性高糖影响INS-1细胞线粒体自噬中的作用1.波动性高糖INS-1细胞模型（1）与NG组相比,SHG组和IHG组降低p-Akt/t-Akt、Tom20、HSP60蛋白表达,增加LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达,SHM组和IHM组无明显差异;与SHG组相比,IHG组上述改变更显著;PI3K抑制剂能进一步加剧波动性高糖的上述作用。（2）与NG组相比,IHG组LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达增加,p-Akt/t-Akt、p-mTOR/t-mTOR、Tom20、HSP60蛋白表达降低;Akt激活剂和mTOR激活剂预处理细胞均能抑制部分波动性高糖的上述作用。（3）与NG组相比,IHG组Beclin1 m RNA表达增加,Tom20、HSP60 m RNA表达降低;Akt激活剂和mTOR激活剂预处理细胞均能抑制部分波动性高糖的上述作用。（4）与NG组相比,IHG组胰岛素分泌减少,ROS含量和细胞凋亡率增加;Akt激活剂和mTOR激活剂预处理细胞均能抑制部分波动性高糖的上述作用。结论:1.波动性高糖较持续性高糖更显著诱导胰岛β细胞功能障碍2.ROS介导的线粒体自噬参与波动性高糖诱导的胰岛β细胞损伤3.PI3K/Akt/mTOR信号通路介导波动性高糖对INS-1细胞线粒体自噬的调节