异源表达稻瘟病菌MgGDH基因对水稻干旱胁迫影响的研究

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谷氨酸脱氨酶(GDH)是生物体内一种重要的胁迫应答酶,对细胞内高浓度的NH4+具有解毒作用。GDH能够催化NH4+与α-酮戊二酸合成谷氨酸,在胁迫作用下利用谷氨酸途径合成脯氨酸。由于高等植物的GDH对NH4+的亲和力低,而微生物的GDH对NH4+有更高的亲和力,因此将微生物的GDH基因异源表达于高等植物中,能够提高植物的抗胁迫能力。为了培育抗干旱的水稻品种,我们克隆了稻瘟病菌的GDH基因(MgGDH)并异源表达于水稻,然后系统研究了干旱和渗透胁迫对转基因水稻的影响,以及MgGDH参与抗旱性响应的分析机制。具体研究结果如下:1.成功克隆了稻瘟病菌中的谷氨酸脱氢酶基因(MgGDH),大小由1392个核苷酸组成。2.为了研究MgGDH的体外酶促动力学特征,通过原核表达并分别纯化了目的基因和水稻内源的重组蛋白,即His-TF-MgGDH和His-TF-Os GDH,得到大小分别为106.5 k Da和126.1 k Da的重组蛋白。通过体外酶活测定,His-TF-MgGDH的NADP(H)-GDH酶活显著高于His-TF-Os GDH的;并且His-TF-MgGDH和His-TF-Os GDH的NADP(H)-GDH酶活都是其氨基化反应大于其去氨基化反应。同时,His-TF-MgGDH对NH4+的Km值(Km=0.67±0.05 m M)要明显小于对谷氨酸的Km值(Km=22.3±0.81 m M)。说明His-TF-MgGDH的NADP(H)-GDH酶活倾向于将NH4+同化为谷氨酸,并且其同化NH4+的能力要显著强于His-TF-Os GDH。3.为了研究MgGDH转基因水稻在干旱胁迫条件下的表型,分别用PEG和土壤干旱分别处理转基因和野生型水稻。通过表型观察发现MgGDH转基因水稻的抗脱水胁迫的能力显高于野生型水稻。4.体外酶促动力学分析得出MgGDH转基因水稻的体外NADP(H)-GDH酶活显著高于野生型的,且氨基化反应明显大于其去氨基化反应。在脱水胁迫处理条件下MgGDH转基因水稻与野生型相比其NH4+含量显著降低,并且其谷氨酸、脯氨酸及可溶性糖含量明显提高。定量PCR结果表明在脱水胁迫处理条件下转基因水稻中与脯氨酸合成及与脯氨酸运输相关的基因的表达明显高于野生型中的。这些结果说明在脱水胁迫处理条件下MgGDH转基因水稻通过降低NH4+的毒害和提高与渗透压相关的物质脯氨酸及可溶性糖的含量来提高其抗脱水胁迫的能力。上述实验结果证明将MgGDH基因过表达于水稻,可提高转基因水稻的抗旱能力。
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