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目的明确高同型半胱氨酸诱导细胞凋亡的机制,探讨核内siah-1聚集在此凋亡过程中所起机制的研究。方法(1)用不同浓度同型半胱氨酸(Hcy)培养C6细胞,模拟高同型半胱氨酸损伤细胞模型,观察Hcy处理后细胞活力变化,CCK-8试剂盒检测各组细胞增值率,选定干预浓度;(2)TUNEL法检测正常组与同型半胱氨酸处理组细胞凋亡程度;(3)实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术测定同型半胱氨酸对C6细胞内siah-1基因、GAPDH基因的m RNA表达;蛋白免疫印迹分析(Western blot)检测siah-1、GAPDH蛋白表达水平的影响;(4)使用免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察同型半胱氨酸处理细胞后胞内siah-1及GAPDH的分布和亚细胞定位改变;(5)用siah-1-si RNA干扰细胞后,real-time PCR及Western blot检测干扰效率;(6)观察siah-1干扰后正常组与同型半胱氨酸处理组细胞核内GAPDH蛋白表达影响,免疫荧光染色激光共聚焦显微镜明确siah-1干扰对GAPDH核转位改变。(7)观察siah-1干扰后正常组与同型半胱氨酸处理组细胞内P53及caspase 3表达的影响。结果(1)CCK-8检测细胞增殖率发现,同型半胱氨酸处理C6细胞48小时后,细胞增殖能力受到明显抑制,且随着同型半胱氨酸浓度增加,细胞增殖能力逐渐下降;(2)TUNEL染色发现:正常组细胞TUNEL阳性染色极少,而同型半胱氨酸处理组细胞TUNEL染色阳性明显增加,提示一定浓度的同型半胱氨酸可促进C6细胞凋亡。(3)Real-time PCR结果显示:同型半胱氨酸诱导细胞48小时后,与对照组相比,Hcy处理组细胞内siah-1、GAPDH m RNA表达明显增加,且随着同型半胱氨酸浓度增加而增加,呈浓度依赖性;(4)Western blot结果提示:同型半胱氨酸诱导细胞48小时后细胞内siah-1、GAPDH蛋白表达也明显增加,同样随着同型半胱氨酸浓度增加而增加,呈浓度依赖性;(5)免疫荧光结果发现,正常组细胞siah-1及GAPDH主要在细胞浆表达,细胞核少有或者无表达,而同型半胱氨酸处理组细胞核内出现siah-1及GAPDH聚集现象;(6)用si RNA干扰后,可有效抑制细胞内siah-1 m RNA和蛋白水平的表达;激光共聚焦荧光显微镜结果显示,干扰siah-1的表达可减少同型半胱氨酸所致的GAPDH的聚集及核转位。提示了siah-1参与了同型半胱氨酸诱导的GAPDH核转位,形成siah-1/GAPDH复合物后,由胞浆向胞核发生转位,发挥促凋亡作用。结论同型半胱氨酸诱导细胞后可诱导C6细胞凋亡,促进细胞内siah-1、GAPDH表达增加,发生由细胞浆向细胞核的转位;干扰siah-1后,可以减少同型半胱氨酸所致核内siah-1及GADPH聚集现象。提示了siah-1参与了GAPDH由胞浆向胞核转位的运动机制,同型半胱氨酸诱导细胞后促进siah-1/GAPDH复合物的形成,并从胞浆转移至胞核,形成核内聚集,最后发生细胞凋亡,而对siah-1进行干扰可能抑制同型半胱氨酸诱导细胞的凋亡作用。