中国鲎幼鲎消化道发育及Hg2+毒性效应研究

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本论文在中国鲎人工繁育基础上,对1龄中国鲎形态性状与体质量进行通径分析及多元回归分析,建立主要形态性状和体质量的多元线性回归方程,为中国鲎生长状况评估和苗种筛选提供理论依据;并通过常规石蜡切片、H-E染色技术对中国鲎消化道发育进行组织学研究,比较不同发育阶段其消化道的形态结构差异,了解消化机能的发育变化,探索中国鲎早期发育阶段的消化特点、营养需求,为中国鲎人工育苗选饵、投喂提供有价值的参考依据,进而为完善苗种培育技术和提高育苗成活率提供理论依据。最后在实验室条件下进行Hg2+对中国鲎幼体的毒性效应研究,旨在了解恶劣环境对放流后幼体的影响,了解幼鲎生存状态及适应情况,企望研究结果能为更好地保护鲎资源,为中国鲎育苗、放流增殖,恢复中国鲎资源提供理论参考。研究结果如下:(1)人工繁育阶段,9对中国鲎共计产卵8.7×104粒,受精率为56%~68%;受精卵经历约45天胚胎发育孵化成1龄幼鲎,孵化率达到92%,共计获得1龄幼鲎4.8万尾。幼鲎各形态性状对于体质量的通径系数均达到极显著水平(P<0.01),其中通径系数最大的是头胸甲宽,说明头胸甲宽对体质量的直接作用最大。各表型性状对体质量的总决定系数Σd=0.863,表明所选形态性状是影响体质量的主要性状。通过逐步回归分析方法,经偏回归系数显著性检验,建立了以体质量为因变量,头胸甲长、头胸甲宽、头胸甲高和腹部长为自变量的多元回归回归方程:Y=-0.228+0.248X1+0.073X2+0.333X3+0.073X4。(2)采用石蜡连续切片和H-E染色技术,对1日龄~2龄及成年中国鲎的消化道进行组织学观察。结果显示,1~15日龄,消化道组织结构尚未出现明显分化,但黏膜上皮结构清晰可见,且已经出现黏膜褶皱。26日龄,食道和胃的黏膜上皮边缘层均出现深色条带,食道的肌纤维呈环向延伸,胃的肌层纤维束增厚。30日龄时中肠和直肠的黏膜上皮顶部出现纹状缘,肌层纤维束增厚。60日龄,食道和胃的黏膜上皮边缘层深色条带发育为纹状缘,食道肌纤维增多,胃的肌层纤维束增厚。70日龄时,中肠和直肠黏膜褶皱高度增高,数量增多,纹状缘着色加深。2龄个体的消化道由黏膜层、黏膜下层、肌肉层及浆膜组成,组织结构基本发育完善,食道和胃黏膜褶皱明显增高,数量增加至9~15个,其黏膜上皮顶部的纹状缘均发育成几丁质层;中肠和直肠黏膜褶皱迅速增高,数量增加至10~12个,中肠黏膜上皮纹状缘增厚,无几丁质层,直肠黏膜上皮的纹状缘发育成几丁质层。成年中国鲎个体的消化道黏膜层、黏膜下层、肌肉层及浆膜均较前期明显增厚,为完整的消化道组织结构。结果表明,中国鲎消化道的组织结构在2龄基本发育完善,且随年龄增长各层组织结构不断完善,这与其2龄开口摄食的生活习性相适应。(3)在实验室条件下,采用静水试验方法进行96 h的Hg2+胁迫对中国鲎幼体的急性毒性实验,并考察了不同质量浓度(0.005、0.025和0.250 mg·L-1)Hg2+处理对幼年中国鲎体内金属硫蛋白(MT)的影响。结果表明:Hg2+对中国鲎幼体的毒性类型为急性Ⅱ,其24 h、48 h、72 h和96 h LC50分别为15.013,7.084,4.008和2.683 mg·L-1,安全质量浓度为0.473 mg·L-1。在安全浓度范围内,不同浓度的Hg2+均能显著诱导MT的产生(P<0.05),MT含量与Hg2+浓度在一定范围的暴露浓度(0~0.025 mg·L-1)和暴露时间(72 h)内表现为正相关;实验组MT含量为对照组的1.152~1.716倍。其中以72 h时0.025 mg·L-1组的MT诱导量最高,为8.93±0.16ng·m L-1。(4)中国鲎幼体Hg2+胁迫响应的转录组分析,Hg2+不同处理天数:对照(HG0)vs处理15天(HG15),对照(HG0)vs处理4天(HG4),处理4天(HG4)vs处理15天(HG15)得到差异表达基因分别为:641,203,163个;其中表现为上调的分别有422、81、142个,表现为下调的分别有219、122、21个。在遭受Hg2+胁迫过程中,与物质合成代谢及免疫相关的基因显著变化,特别是与氨基酸代谢以及抗氧化酶活性相关的基因差异显著。Hg2+处理4 d与对照组相比主要是物质分解代谢以及氧化还原酶活性的基因差异表达显著。Hg2+处理15 d与对照组相比发生显著差异表达基因主要富集功能为物质合成以及氧化还原酶活性。Hg2+处理4 d与15 d差异表达的基因富集在物质结合功能上。这些变化反映了1龄中国鲎遭受Hg2+胁迫时通过调整机体的物质合成代谢以及抗氧化酶活性以抵抗Hg2+胁迫对机体的伤害。
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