老年性骨质疏松症(senile osteoporosis,SOP)是因破骨细胞增龄性骨吸收增强及成骨细胞增龄性骨形成减弱,从而导致骨量丢失及骨结构变化,严重危害患者健康,随社会老龄化人口的增多,这一问题尤显突出。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是随着增龄性变化出现成骨分化能力减弱,并通过分泌相关因子激活破骨细胞活性。因此,BMSCs生物学性能改变在SOP发生中具有重要作用。前期研究发现,核基质蛋白特异AT序列结合蛋白2(special AT-rich binding protein 2,SATB2)可调控人颌骨来源的BMSCs的增龄特性改变。而非编码小RNA(microRNA,miRNA)-31(miR-31)能与SATB2启动子区域结合,并沉默其表达。因此,我们提出如下假设:miR-31-SATB2是否调控BMSCs增龄性改变并在老年性骨质疏松发生中发挥重要作用?本课题在检测不同年龄组大鼠BMSCs体外生物学特征及miR-31表达的基础上,分析miR-31表达对BMSCs衰老及成骨分化、激活破骨分化能力的影响,并通过自然增龄性大鼠模型miR-31抑制剂对增龄性骨质疏松的防治作用。为SOP的诊断与治疗提供新的理论与实验基础。第一部分大鼠BMSCs的增龄性生物学特征及miR-31表达分析目的:探讨不同年龄大鼠BMSCs体外生物学特征,分析雄性大鼠自然增龄、雌性大鼠去势、体外细胞传代复制情况下BMSCs中miR-31的表达。方法:(1)大鼠股骨来源的BMSCs采用全骨髓贴壁法体外提取并培养,当单克隆集落形成并且相互接触时进行传代培养;(2)不同年龄组BMSCs用结晶紫染液及Brdu染色并培养8d,并检测克隆形成;(3)上述细胞各组增殖能力用CCK8法分析;(4)不同组BMSCs的相关干性因子经Western blot检测蛋白表达;(5)大鼠BMSCs经矿化诱导液或成脂诱导液培养并利用实时定量PCR、Western blot、茜素红钙结节染色及油红O染色等方法检测多向分化潜能;(6)各组通过β-Gal染色检测BMSCs衰老、γ-H2AX荧光检测DNA损伤及Western blot分析相关衰老因子表达;(7)实时定量PCR检测增龄、去势、复制衰老后BMSCs中miR-31表达水平。结果:(1)年轻(Y)组大鼠BMSCs克隆集落显著多于中年(M)组及老年(O)组;并且随年龄增长,克隆形成下降;CCK8实验显示从培养第三天开始Y组BMSCs吸光度值大于M组且大于O组;(2)随着年龄增长,BMSCs中相关干性因子Nanog、SOX2、OCT4蛋白表达下降;(3)BMSCs中成骨相关蛋白如SATB2、Osx(osterix)、OCN(osteocalcin)等表达水平O组明显低于Y组及M组,并且钙结节形成数下降;随着年龄增加,O组BMSCs中成脂相关因子如LPL、PPAR-γ、C/EBP-α的mRNA表达升高,油红O染色标记形成的脂滴数O组明显多于M组与Y组;(3)随年龄增长,衰老相关β-Gal染色及DNA损伤相关γ-H2AX荧光的阳性细胞比率明显增加,衰老相关蛋白如P16、P21、P53等表达升高;(4)自然增龄、去势、复制衰老后BMSCs中miR-31的表达水平显著升高。结论:BMSCs增龄性生物学特征改变主要是干性及成骨分化能力的减弱,成脂分化能力增强、细胞衰老增多。在BMSC增龄性变化过程中,miR-31表达水平升高,提示miR-31可能参与BMSCs增龄性变化的调控。第二部分 miR-31对大鼠BMSC衰老及成骨分化能力的影响目的:探讨不同miR-31水平变化对BMSCs衰老及成骨诱导分化能力的影响。方法:(1)通过miR-31抑制剂转染O组、模拟剂转染Y组BMSCs,利用β-Gal染色与γ-H2AX荧光分析BMSCs衰老及DNA损伤情况;(2)不同转染组细胞经成骨诱导后Western blot检测SATB2、Osx、OCN等成骨相关基因表达;(3)茜素红钙结节染色实验检测成骨分化能力。结果:(1)O组BMSCs抑制miR-31表达后,衰老染色阳性细胞数减少,DNA损伤减少,成骨分化能力增强,SATB2、Osx、OCN等蛋白表达升高;(2)反之,年轻组BMSCs转染miR-31模拟剂后,衰老染色阳性细胞数增多,DNA损伤增加,成骨分化能力下降,SATB2、Osx、OCN表达水平下降。结论:miR-31是影响BMSCs衰老及成骨分化能力的重要调节因子。第三部分BMSCs通过分泌miR-31调控破骨细胞分化和功能目的:检测Y组、O组BMSCs微环境中miR-31表达,并分析其诱导破骨细胞分化和功能的影响,探讨BMSCs通过分泌miR-31调控破骨细胞分化和功能的机制。方法:(1)通过对Y及O组BMSCs的上清液进行超速离心,提取外泌体,并利用miRNeasymini试剂盒提取总RNA,实时定量PCR检测其中miR-31的表达水平;(2)O组BMSCs经细胞膜红荧光标记探针(DiI)标记染色后,提取细胞上清液与4月龄大鼠的股骨骨髓组织共培养,检测荧光以验证外泌体包裹miR-31诱导破骨细胞分化的作用;(3)Y及O组的BMSCs上清液、O组上清液加miR-31抑制剂与4月龄大鼠的骨髓细胞共培养诱导破骨细胞分化,TRAP染色检测破骨细胞数;(4)上述共培养体系置于牙本质片表面培养,检测吸收的骨片面积。结果:(1)PCR检测结果示O组上清液中miR-31表达水平明显高于年轻组;(2)共培养后可见破骨细胞中DiI染色阳性区域(红色);(3)TRAP染色结果O组破骨细胞数多于Y组,O组抑制miR-31后破骨细胞数减少。(4)牙本质骨片吸收实验:O组骨吸收面积大Y组,O组抑制miR-31后骨吸收面积明显降低。结论:BMSCs微环境中miR-31表达随年龄增长而增加,O组诱导破骨分化能力强于Y组;O组抑制miR-31表达后,诱导破骨细胞分化和功能减弱;其机制可能为BMSCs通过外泌体形式分泌miR-31并调控破骨细胞的分化和功能。第四部分miR-31抑制剂防治增龄性骨质疏松的动物实验研究目的:探讨miR-31抑制剂防治增龄性骨质疏松的有效性和可行性。方法:通过动物体内实验,将miR-31抑制剂局部注射15月龄大鼠股骨骨髓腔内,3个月后micro CT检测股骨远心端骨密度、骨小梁厚度等,HE、TRAP染色显示骨形成及骨吸收情况。结果:(1)miR-31抑制剂注射后的大鼠股骨远心端骨BV/TV等差异明显,骨小梁厚度及密度均增加,骨小梁间隙减少;(2)HE染色结果显示抑制miR-31后骨细胞数增多,骨小梁增多;(3)TRAP染色显示miR-31抑制后破骨细胞数明显减少。结论:体内注射miR-31抑制剂可逆转大鼠BMSCs增龄性骨吸收及骨量丢失,有可能成为防治骨质疏松症的新手段。