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鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis, DVH）是由鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus, DHV）引起的3周龄内雏鸭的一种急性、高度接触性和致死性的传染病，引起雏鸭以角弓反张和肝脏病变为主要特征的临床变化。DHV主要包括小RNA病毒科禽肝病毒属鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus, DHAV）和星状病毒科禽星状病毒属的鸭星状病毒（Duck astrovirus, DAstV）。DHAV分为1型、2型和3型3个血清型，其中3型DHAV（Duck hepatitis A virus type 3, DHAV-3）在我国鸭群中已普遍流行，给养鸭业生产造成严重损失，不得不引起高度重视。目前，用于预防DHAV-3主要是使用弱毒疫苗和灭活疫苗，但目前的商品化疫苗在雏鸭免疫后尚不能产生快速而高效的保护。乳酸菌活载体口服微生态制剂因其可直接口服，给药方便，安全无毒等特点被广泛运用。本研究将3型鸭甲型肝炎病毒主要保护性抗原蛋白VP1导入食品级乳酸菌表达系统，构建表达VP1蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫制剂。研究内容主要分为以下两个部分： 第一部分：3型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白重组乳酸乳球菌的构建 乳酸乳球菌是人与动物肠道中常见的益生菌，被公认为是安全级的微生物，并能够刺激机体产生细胞免疫和体液免疫。因此本试验选择食品级乳酸乳球菌表达系统，即利用食品级益生菌乳酸乳球菌作为黏膜免疫抗原呈递载体。首先通过PCR技术扩增DHAV-3的VP1全基因，然后通过融合PCR技术将VP1与乳酸菌表达载体pNZ8149连接并构建到大肠杆菌克隆载体pEASY-T5 Zero上，通过单酶切技术和T4 DNA连接酶使pNZ8149-VP1自身环化并转化至乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞中，以nisin作为诱导剂对重组菌株进行诱导表达，通过Western blot鉴定重组菌株VP1蛋白表达情况。Western blot检测结果显示在培养基上清、菌体超声破碎的上清液中没有特异性条带出现，而在菌体超声破碎的沉淀中于29kDa处出现特异性目的蛋白条带，表明DHAV-3的VP1全基因在重组乳酸乳球菌胞内成功得到了表达。 第二部分：表达VP1蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫研究 将含pNZ8149-VP1重组质粒的乳酸乳球菌采用灌胃给药方式口服免疫BALB/c小鼠，免疫间隔时间为一周，每次连免3天，共免疫3次，在首次免疫后的10、20、30、37、44、51天每组随机选取3只小鼠进行眼球采血和小肠粘膜的提取，通过检测 DHAV特异性抗体水平，淋巴细胞转化率以及细胞因子水平分析重组乳酸乳球菌对小鼠的免疫效果。研究结果显示小鼠口服含pNZ8149-VP1重组质粒的乳酸乳球菌能诱导特异性血清IgG和肠粘膜sIgA的产生，促进淋巴细胞增殖，IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ各细胞因子水平与PBS组和空载体对照组比较有显著性提高，且在30天时免疫效果最好。研究表明，表达DHAV-3 VP1蛋白的重组乳酸乳球菌免疫微生态制剂具有广泛的应用前景，能引起小鼠特异性的体液免疫反应并能促进细胞免疫应答，通过体液免疫和细胞免疫等免疫指标测定，评价重组乳酸乳球菌表达系统的免疫原性，为研制重组乳酸乳球菌口服动物免疫制剂防治3型鸭病毒性肝炎奠定了基础。