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背景:环境内分泌干扰物(environmental endocrine disruptors,EEDs)可以干扰正常的内分泌功能。全氟和多氟烷酸类化合物(perfluoroalkyl and polyfluoroalkyl substances,PFASs)是一类EEDs,广泛用于生产和生活领域,如纺织品、造纸、航空和电镀等。由于结构稳定、不易降解,PFASs作为一种新型的持久性有机污染物(persistent organic pollutants,POPs)通过生物富集效应在环境中广泛存在。目前已经证实PFASs对水生生物和哺乳动物具有广泛的毒性作用,包括肝毒性,免疫毒性,神经毒性,内分泌毒性,生殖和发育毒性,潜在的遗传和致癌性。最典型和应用最广泛的PFASs是全氟辛酸(perfluorooctanoic acid,PFOA)。PFOA与传统的POPs不同,其对蛋白质具有较高的亲和力,与蛋白质结合后,通过肠肝循环被广泛摄取,在体内很难被代谢和转化,主要通过尿液和粪便排出,因此PFOA在人体内半衰期很长,约为3.5年。人类通过饮食、空气、职业等途径暴露于PFOA,其中饮用水污染是最主要的暴露途径。目前PFOA在全世界各地区的人体血液样品中均有检出,故探究PFOA对人类生殖的影响已成为一个亟待解决的全球性问题。细胞间缝隙连接通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)是由两个接头形成的相邻细胞间的膜通道,是相邻细胞间特殊的相互作用模式,其充当细胞间物质交换的通道,小的亲水性分子可以通过GJIC被动扩散。因此,缝隙连接在广泛的生理过程中起着至关重要的作用,包括调节细胞生长和分化,维持组织稳态和胚胎发生。GJIC对卵巢卵泡发育的全过程至关重要。在卵巢卵泡生长期间,GJIC将生长的卵母细胞与相邻的颗粒细胞和颗粒细胞相互连接,形成功能性代谢单元。已有研究表明连接蛋白43(Connexin 43,Cx43)和连接蛋白37(Connexin37,Cx37)是卵巢组织中GJIC的主要成分。最近,有研究证实,PFOA可破坏卵母细胞和颗粒细胞之间的GJIC,从而影响小鼠卵母细胞的质量。许多研究表明,PFOA暴露可能会对细胞产生毒性作用,诱导细胞凋亡。例如,Eun等发现PFOA通过破坏成骨细胞中的线粒体功能,导致成骨细胞凋亡。Chen等发现PFOA暴露通过氧化应激诱导妊娠小鼠黄体细胞凋亡抑制黄体功能。Kan等使用iTRAQ和western blot技术检测肝脏样品的组织学和蛋白质组学变化,结果显示剂量依赖性的肝细胞凋亡和过氧化物酶体增殖。但目前关于凋亡途径的研究主要集中于细胞内信号转导途径,而忽略了细胞微环境和邻近细胞对细胞凋亡的影响。但这并不排除GJIC与细胞凋亡之间存在某种机械联系的可能性。例如,睾丸支持细胞中Cx43的缺失导致出生后精原细胞停滞,生殖细胞数量减少和精子发生受损。Rita等报道,编码连接蛋白26((Connexin 26,Cx26)的基因GJB2突变导致耳蜗导管细胞凋亡和氧化损伤,导致感音神经性听力丧失。PFOA作为EEDs可以诱导生殖毒性,但是目前仍没有关于PFOA对哺乳动物卵巢颗粒细胞细胞毒性的实验报道,且GJIC在PFOA诱导的颗粒细胞存活和凋亡中发挥作用的机制仍未可知。我们假设PFOA诱导的连接蛋白表达下调,减少了 GJ1C,导致卵巢颗粒细胞的凋亡。在本研究中,我们研究了 PFOA对人卵巢颗粒细胞中GJIC和连接蛋白表达的影响,然后通过人卵巢颗粒细胞系(KGN)研究了 PFOA对细胞凋亡的可能影响及GJIC在其中发挥的作用。目的:研究PFOA暴露对卵巢颗粒细胞GJIC的影响,探讨GJIC以及连接蛋白在PFOA诱导的卵巢颗粒细胞凋亡中作用及相关机制。材料与方法:1)收集2017年9月-2018年1月在浙江大学医学院附属妇产科医院生殖医学中心因输卵管因素不孕而接受体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)或因单纯男性因素不育而接受卵细胞浆单精子注射(oocyte intracellular sperm injection,ICSI)治疗的不孕症患者 41例,年龄在20-39岁之间。留取取卵日所有的卵泡穿刺液,用Fiecoll梯度离心法分离颗粒细胞。2)建立人原代颗粒细胞体外培养体系,不同浓度PFOA(0、0.3μM、3μM、30μM)处理24小时后,收集细胞提取总RNA和蛋白质。RT-PCR检测患者颗粒细胞缝隙连接相关基因Cx43mRNA、Cx37mRNA的表达,Western Blot检测细胞缝隙连接相关蛋白Cx43、Cx37的表达。3)利用KGN细胞系,加入不同浓度PFOA(0、0.03μM、0.3μM、3μM、30μM、300μM)及缝隙连接调节剂RA(10μM)和CBX(50mM),分别作用0小时、12小时、24小时、36小时和48小时。4)通过CCK-8检测细胞活力,SL/DT技术检测GJIC活力,Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测KGN细胞的凋亡,Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达。5)所有数据使用SPSS16.0软件包进行统计学分析。结果:1)人原代卵巢颗粒细胞体外培养处理和检测结果表明:与阴性对照组相比,PFOA暴露后,卵巢颗粒细胞Cx43mRNA和蛋白水平均呈浓度依赖性表达下降(P<0.05),但Cx37mRNA水平表达下降,而在蛋白水平则无明显变化(P>0.05)。2)KGN细胞系培养处理和检测结果:①.CCK-8检测结果显示,与空白对照组相比,PFOA以浓度-时间依赖性的方式抑制KGN细胞的活力,且在PFOA(30μM)暴露24小时最为典型。相比于空白对照组和单纯PFOA处理组,用RA、CBX处理对细胞活力的影响不明显,但与单纯PFOA处理组相比,CBX+PFOA处理显著性抑制细胞活力(P<0.05),RA+PFOA处理显著性增加细胞活力(P<0.05)。②.SL/DT实验显示,.与阴性对照组相比,PFOA暴露抑制KGN细胞GJIC活力(P<0.05)。与单纯PFOA处理组相比,CBX+PFOA处理GJIC 活力下调(P<0.05),RA+PFOA 处理 GJIC 活力上调(P<0.05)。③.流式细胞术检测凋亡显示,与阴性对照组相比,PFOA暴露诱导KGN细胞凋亡(P<0:05),与单纯PFOA处理组相比,CBX增加PFOA诱导的KGN细胞凋亡(P<0.05),RA降低PFOA诱导的KGN细胞凋亡(P<0.05)。④.Western blot结果显示,PFOA暴露下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,而促凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-caspase3的表达上调,差异有统计学意义。结论:1)PFOA暴露可降调卵巢颗粒细胞GJIC相关基因的表达、抑制GJIC的活力。2)PFOA可能通过抑制GJIC从而影响卵巢颗粒细胞的增殖,最终导致细胞凋亡。