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NK/T细胞淋巴瘤(NK/T-cell lymphoma, NKTCL)是一种我国高发的特殊类型非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL),患者病情临床急速进展,病理诊断困难。虽然近年来随着诊疗技术的提高及化学治疗和生物治疗等综合治疗方法的不断改进,但是患者预后仍然较差。因此,NK/T细胞淋巴瘤最终治疗突破的关键在于分子生物学的基础上探索其新的诊断和治疗及预后指标。泛素蛋白酶体系统(Ubiquitin proteasome system, UPS)和去泛素化酶(deubiquitinating enzymes, DUBS)广泛存在人体细胞组织当中,它们能识别并特异调节靶向底物蛋白的降解,共同调节人体而参与基因转录、细胞增殖和凋亡、细胞周期进程、肿瘤生长等多项重要生理和病理过程。随着肿瘤干细胞研究的进展人们在多种肿瘤细胞中发现存在多个与干细胞调控密切相关的关键基因的异常表达,这些异常表达的基因有可能在调控肿瘤细胞失控的异常的无限制增殖和演变方面起着重要的作用。USP22(ubiquitin-specific processing peptidase22, USP22)是泛素特异性加工酶家族主要成员之一,在人类多种正常组织如心肌、肺脏和神经系统及生殖系统等中都有表达,参与多项重要生理和病理过程。近年来在乳腺癌、直肠癌和胃癌等多种肿瘤组织细胞中发现USP22高表达,因而被称为新的肿瘤干细胞标志基因。有关USP22在NK/T细胞淋巴瘤中的表达及其意义的研究,迄今国内外鲜有报道。为深入探讨USP22基因与NK/T细胞淋巴瘤恶性生物学行为的关系,明确USP22在NK/T细胞淋巴瘤发生、发展中的作用,寻求NK/T细胞淋巴瘤诊断和预后判断的有效指标及寻找治疗NK/T细胞淋巴瘤的特异性基因位点,本研究检测了NK/T细胞淋巴瘤组织、腺样体组织和鼻腔粘膜组织中USP22的表达情况,初步探讨了USP22与NK/T细胞淋巴瘤临床恶性生物学行为的关系。本研究进一步重组了携带USP22mRNA编码区全长反转录cDNA序列和siRNA序列的真核质粒表达载体来研究USP22对NK/T细胞淋巴瘤SNK-6细胞生物学行为的影响及p-Akt、Bcl-2/Bax和Survivin表达水平的影响；检测了USP22对SNK-6细胞药物敏感性的影响及对耐药基因MDRl和MRP表达水平的影响；通过建立裸鼠移植瘤模型进行体内试验,进而深入探讨USP22对NK/T细胞淋巴瘤SNK-6细胞的影响。本实验试图从体内外来阐明USP22基因在NK/T细胞淋巴瘤发生、发展中的意义；并进一步阐明USP22在NK/T细胞淋巴瘤发生、发展中的功能及与p-Akt、 Bcl-2/Bax和Survivin的表达的关系。本研究探讨USP22基因作为NK/T细胞淋巴瘤基因治疗靶点的可行性,为NK/T细胞淋巴瘤的基因治疗提供了理论基础。本研究共分以下4章。第一章：USP22在NK/T细胞淋巴瘤组织中的表达及意义方法采用免疫组织化学、Real-time PCR和western的方法检测73例NK/T细胞淋巴瘤组织、30例腺样体组织和15例鼻腔粘膜组织中USP22的表达情况。结果NK/T细胞淋巴瘤组织USP22阳性表达高于腺样体组织和鼻腔粘膜组织,表达差异有统计学意义(P＜0.01)。USP22P表达率与NK/T细胞淋巴瘤患者临床分期和LDH表达水平有关(P<0.05)。第二章：USP22对NK/T细胞淋巴瘤SNK-6细胞影响的体外研究方法1.构建携带人USP22mRNA编码区全长cDNA序列和特异性siRN腑列的真核表达质粒载体,转染并筛选出阳性稳定转染细胞克隆。2.采用MTT法测定对照组和各转染组SNK-6细胞增殖能力。3.采用流式细胞术(FCM)测定对照组和各转染组SNK-6细胞周期和凋亡的情况。4.采用Real-time PCR和Western blot的方法检测对照组和各转染组SNK-6细胞/Akt、Bcl-2/Bax和Survivin表达的情况。结果1.pcDNA3.1-USP22s和pSUPER-EGFP-USP22s真核表达载体构建及转染SNK-6细胞成功。2.MTT实验结果显示：与对照组相比,pcDNA3.1-USP22-3组细胞增殖能力明显增强,而pSUPER-EGFP-USP22-a组细胞增殖能力明显减弱(P<0.05),pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空质粒组则无明显差异(P>0.05)。3.FCM结果显示：与对照组相比,pcDNA3.1-USP22-3组G0/G1期细胞比例明显减少(P＜0.01),S期细胞比例升高(P＜0.05)；pSUPER-EGFP-USP22-a组G0/G1期细胞比例明显升高(P＜0.01),S期细胞比例减少(P＜0.05),凋亡率增加(P＜0.01)：pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空质粒组则无明显差异(P＞0.05)。4、Real-time PCR和western结果显示：与对照组相比,pcDNA3.1-USP22-3组细胞p-Akt蛋白、Bcl-2/Bax和Survivin mRNA和蛋白表达升高,而在pSUPER-EGFP-USP22-a组表达降低(P<0.05), pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空质粒组表达则无明显差异(P>0.05)。第三章：USP22对NK/T细胞淋巴瘤SNK-6细胞药物敏感性的影响及机制研究方法1.采用MTT方法检测顺铂对人NK/T细胞淋巴瘤各组SNK-6细胞增殖的影响并计算抑制率。2.采用FCM检测顺铂对人NK/T细胞淋巴瘤各组SNK-6细胞周期和凋亡率的影响。3.采用Real-time PCR和Western方法检测USP22对SNK-6细胞MDR1和MRPmRNA泖蛋白表达水平的影响。结果：1.MTT结果显示:USP22可以对抗顺铂诱导的SNK-6细胞的增殖抑制作用,减弱顺铂药物毒性(P＜0.01)。2,FCM结果显示:USP22可以对抗顺铂诱导的SNK-6细胞细胞G1/G0期周期阻滞和凋亡作用(P＜0.01)。3.Real-time PCR和Western blot结果显示：与对照组相比,pcDNA3.1和pSUPER-EGFP组细胞MDR1和MRP表达水平无明显差异(t＞0.05),pcDNA3.1-USP22-3组升高,而在pSUPER-EGFP-USP22-a组降低(P＜0.01)。第四章：USP22对NK/T细胞淋巴瘤SNK-6细胞裸鼠移植瘤的影响及机制研究方法1.建立人NK/T细胞淋巴瘤裸鼠移植瘤模型。分为对照组、pcDNA3.1-USP22-3组、pSUPER-EGFP-USP22-a组。每周测量瘤体大小,绘制肿瘤体积生长曲线。治疗终止时处死小鼠,剥除肿瘤称重,计算抑瘤率。2.采用TUNEL法检测各组裸鼠移植瘤组织中肿瘤细胞凋亡情况,统计细胞凋亡指数。3.采用Real-time PCR并western检测各组裸鼠移植瘤组织中USP22、p-Akt、 Bcl-2/Bax和Survivin表达情况。Results1.pcDNA3.1-USP22-3组裸鼠移植瘤体积显著大于对照组裸鼠移植瘤体积,组间比较差异具有统计学意义；pSUPER-EGFP-USP22-a组裸鼠移植瘤体积显著小于对照组裸鼠移植瘤体积,组间比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。2.TUNEL结果显示pSUPER-EGFP-USP22-a组裸鼠移植瘤组织中凋亡细胞与对照组相比明显增多,组间比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。3.pcDNA3.1-USP22-3组裸鼠移植瘤USP22mRNA和蛋白表达显著高于对照组,组间比较差异具有统计学意义；pSUPER-EGFP-USP22-a组显著低于对照组,组间比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。pcDNA3.1-USP22-3组裸鼠移植瘤p-Akt蛋白及Bcl-2/Bax和Survivin mRNA和蛋白表达显著高于对照组,组『间J比较差异具有统计学意义；pSUPER-EGFP-USP22-a组显著低于对照组,组间比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。结论1. USP22在NK/T细胞淋巴瘤组织中高表达,与NK/T细胞淋巴瘤的临床分期和LDH水平密切相关；USP22促进NK/T细胞淋巴瘤SNK-6细胞的增殖,当抑制其表达时会导致细胞增殖能力的减弱,阻滞细胞于G0/G1期,诱导凋亡,增加化疗药物敏感性。2.USP22通过调控p-Akt、Bcl-2/Bax和Survivin的表达来参与NK/T细胞淋巴瘤的发生、发展。USP22通过调控MDR1和MRP的表达来参与NK/T细胞淋巴瘤肿瘤耐药性。3.体内试验与体外实验结果相似,USP22可以促进裸鼠移植瘤的生长,其作用机制与调控p-Akt、Bcl-2/Bax和Survivin的表达密切相关。