目的:探讨Toll样受体4(Toll-like Receptor 4;TLR-4)对外伤后小胶质细胞极性转化的影响及其机制与在创伤性颅脑损伤发挥的作用。方法:对比研究TLR4基因敲除型(TLR4(-/-))/野生型(TLR4(+/+))小鼠在自由落体脑外伤模型(CCI)后不同时间点学习能力、水肿、炎症反应等的变化。通过Morris水迷宫实验比较各组小鼠伤后高级神经功能;MRI比较各组小鼠水肿面积的变化。RT-q PCR与Western Blot比较各组小胶质细胞M1/M2表型标记物的变化(M1表型标记物:i NOS、TNF-α、IL-1β;M2表型标记物:Arg-1、VEGF、IL-10、IL-4)。行TLR4基因敲除型/野生型小鼠原代小胶质细胞培养,鉴定,体外实验,免疫荧光观察小胶质细胞形态变化,RT-q PCR比较各组小胶质细胞M1/M2表型标记物表达变化。Western Blot比较动物实验各组重要信号分子Myd88,ERK1/2,NF-κB,RAC-1及AKT的改变。结果:在行自由落体脑外伤模型24h后,TLR4(-/-)小鼠寻找平台潜伏期明显短于TLR4(+/+)小鼠(p<0.05);TLR4(-/-)小鼠穿越平台的次数明显多于TLR4(+/+)小鼠(p<0.05);TLR4(-/-)小鼠的水肿面积明显小于TLR4(+/+)小鼠(p<0.05)。CCI模型后,在m RNA水平,TLR4(-/-)小鼠Arg-1、IL-10的表达较TLR4(+/+)小鼠增加(p<0.05),而i NOS、IL-1β较TLR4(+/+)小鼠明显减少(p<0.05);在蛋白水平,TLR4(-/-)小鼠Arg-1、VEGF的表达较TLR4(+/+)小鼠增加(p<0.05),而i NOS、TNF-α较TLR4(+/+)小鼠明显减少(p<0.05)。原代小胶质细胞鉴定,细胞纯度大于90%,行体外刺激后,TLR4(-/-)原代小胶质细胞形态上更趋向于M2型,其i NOS、TNF-α、IL-1β的表达明显低于野生型原代小胶质细胞(p<0.05),而Arg-1、VEGF、IL-10、IL-4的表达则明显上调(p<0.05)。另外,TLR4(-/-)小鼠Myd88/NF-κB及ERK1/2的激活在伤后24h明显低于TLR4(+/+)小鼠(p<0.05),而RAC-1的活性及AKT的磷酸化明显高于TLR4(+/+)小鼠(p<0.05)。结论:在创伤性颅脑损伤中,TLR4促进小胶质细胞向M1型极化,从而启动与促进脑外伤中的炎症反应,加重外伤后的脑水肿与继发性损伤,加重神经功能损伤。在创伤性颅脑损伤中,TLR4的下游的Myd88/ERK1/2/NF-κB及信号通路的激活在损伤中发挥重要。同时,RAC-1及PI3K/AKT信号通路可能在创伤性颅脑损伤中发挥保护作用。第一部分:Toll样受体4抑制脑外伤后神经功能的修复目的探讨TLR4对小鼠体脑外伤模型后神经功能、认知与学习能力及水肿面积的影响。方法对比研究TLR4基因敲除型(TLR4(-/-))/野生型(TLR4(+/+))小鼠在自由落体脑外伤模型后不同时间点,神经功能、认知与学习能力及水肿面积的变化。分组为:1、假手术组(sham):12只;2、野生型小鼠行自由落体脑外伤模型组((TLR4(+/+)CCI):12只;3、TLR4基因敲除型小鼠行自由落体脑外伤模型组(TLR4(-/-)CCI):12只。自由落体脑外伤模型组均使用BW-ZYQ精细颅脑撞击仪精确撞击小鼠脑皮质(打击头直径:2.5 mm;打击深度:1.0 mm;砝码重量:10.0g;打击高度:2cm);假手术组除不行撞击外,余均与CCI组相同。于建模后24h,行Morris水迷宫实验比较各组神经功能及认知与学习能力;采用MRI比较各组水肿面积的变化。结果与对照组比较,TLR4(+/+)CCI组与TLR4(-/-)CCI组寻找平台潜伏期均明显延长,TLR4(-/-)CCI组寻找平台潜伏期明显短于TLR4(+/+)CCI组(p<0.05);与sham组相比,TLR4(+/+)CCI组与TLR4(-/-)CCI组穿越平台的次数均明显减少,TLR4(-/-)CCI组穿越平台的次数明显多于TLR4(+/+)CCI组(p<0.05)。sham组在MRI中未见到水肿灶,而TLR4(+/+)CCI组与TLR4(-/-)CCI组在伤后均可见明显水肿灶(P<0.01)。TLR4(-/-)CCI组水肿灶面积小于TLR4(+/+)CCI组(P<0.05)。结论在创伤性颅脑损伤中,TLR4的激活抑制脑外伤后神经功能的恢复,并加重外伤后的脑水肿。通过敲除TLR4后,可明显改善创伤性颅脑损伤中的神经功能,减轻外伤后脑水肿。第二部分:Toll样受体4促进脑外伤后小胶质细胞向M1型极化目的探讨TLR4对小鼠体脑外伤模型后小胶细胞M1/M2表型转化的影响。方法对比研究TLR4基因敲除型(TLR4(-/-))/野生型(TLR4(+/+))小鼠在自由落体脑外伤模型后不同时间点,小胶细胞M1/M2表型标记物的表达变化。取TLR4基因敲除型TLR4(-/-)/野生型TLR4(+/+)小鼠,分组为:1、假手术组(sham):5只;2、野生型小鼠行自由落体脑外伤模型组((TLR4(+/+)CCI):5只;3、TLR4基因敲除型小鼠行自由落体脑外伤模型组(TLR4(-/-)CCI):5只。自由落体脑外伤模型组均使用BW-ZYQ精细颅脑撞击仪精确撞击小鼠脑皮质(打击头直径:2.5 mm;打击深度:1.0 mm;砝码重量:10.0g;打击高度:2cm);sham组除不行撞击外,余均与CCI组相同。于建模后24h,3d,7d取伤灶及周围去脑组织,分别提m RNA及蛋白,行RT-q PCR与Western Blot比较各组小胶质细胞M1/M2表型标记物表达改变(M1表型标记物:i NOS、TNF-α、IL-1β;M2表型标记物:Arg-1、VEGF、IL-4、IL-10)。于建模后24h,3d,7d分别麻醉下断头取脑,固定,切片,免疫荧光染色,对比各组伤灶周边活化小胶质细胞数量变化。行TLR4基因敲除型/野生型小鼠原代小胶质细胞培养,鉴定,体外刺激实验,免疫荧光观察小胶质细胞形态变化,RT-q PCR比较各组小胶质细胞M1/M2表型标记物表达改变。结果在m RNA水平,TLR4(+/+)CCI组与TLR4(-/-)CCI组在伤后24h,3d,7d,i NOS、IL-1β、Arg-1、IL-10较假手术组均明显升高。在伤后24h,3d,7d,TLR4(-/-)CCI组IL-1β的表达明显低于TLR4(+/+)CCI组(P<0.05);伤后3d,7d,TLR4(-/-)CCI组i NOS的表达亦明显低于TLR4(+/+)CCI组(P<0.05)。另外,在伤后24h,3d,7d三个时间点,TLR4(-/-)CCI组炎症抑制因子IL-10的表达明显高于TLR4(+/+)CCI组(P<0.05);Arg-1的表达TLR4(-/-)CCI组亦明显高于TLR4(+/+)CCI组(P<0.05)。在蛋白质水平,TLR4(+/+)CCI组与TLR4(-/-)CCI组在伤后24h,3d,7d,i NOS、TNF-α、Arg-1、VEGF较假手术组均明显升高。在伤后24h,3d,7d,TLR4(-/-)CCI组TNF-α的表达明显低于TLR4(+/+)CCI组(P<0.05);伤后3d,7d,TLR4(-/-)CCI组i NOS的表达亦明显低于TLR4(+/+)TBI组(P<0.05)。另外,在伤后24h,3d,7d三个时间点,TLR4(-/-)CCI组小胶质细胞M2型标记物Arg-1的表达明显高于TLR4(+/+)CCI组(P<0.05);VEGF的表达TLR4(-/-)CCI组亦明显高于TLR4(+/+)CCI组(P<0.05)。原代小胶质细胞鉴定显示,细胞纯度大于90%,给予重组IL-4刺激后,TLR4基因敲除型原代小胶质细胞形态上更趋向于M2型,其i NOS、TNF-α、IL-1β的表达明显低于野生型原代小胶质细胞(p<0.05),而Arg-1、BDNF、IGF-1、IL-10的表达则更多(p<0.05)。结论在创伤性颅脑损伤中,TLR4的激活启动炎症反应,促进小胶质细胞向M1型极化,抑制其向M2型极化。通过敲除TLR4基因可明显减轻外伤后炎症反应,降低小胶质细胞向M1型极化,促进其向M2型极化。在体外培养的小胶质细胞上,通过敲除TLR4基因后,小胶质细胞向M2型极化更明显。第三部分:Myd88/ERK/NF-κB信号通路及RAC-1的作用目的探讨TLR4的下游信号Myd88/ERK/NF-κB信号通路及RAC-1在外伤后的表达变化。方法对比研究TLR4基因敲除型(TLR4(-/-))/野生型(TLR4(+/+))小鼠在自由落体脑外伤模型后不同时间点,下游信号Myd88/ERK/NF-κB信号通路及RAC-1在外伤后的表达变化。取TLR4基因敲除型TLR4(-/-)/野生型TLR4(+/+)小鼠,分组为:1、假手术组(sham):5只;2、野生型小鼠行自由落体脑外伤模型组((TLR4(+/+)CCI):5只;3、TLR4基因敲除型小鼠行自由落体脑外伤模型组(TLR4(-/-)CCI):5只。自由落体脑外伤模型组均使用BW-ZYQ精细颅脑撞击仪精确撞击小鼠脑皮质(打击头直径:2.5 mm;打击深度:1.0 mm;砝码重量:10.0g;打击高度:2cm);sham组除不行撞击外,余均与CCI组相同。于建模后24h提取伤灶及周围脑组织,提蛋白,行Western Blot比较各组Myd88/ERK/NF-κB信号通路及RAC-1、AKT的表达变化。结果与对照组比较,TLR4(+/+)CCI组与TLR4(-/-)CCI组在伤后24h,My D88、p ERK1/2、p NF-κB p65均明显升高(P<0.01)。TLR4(-/-)CCI组My D88的相对表达量明显低于TLR4(+/+)CCI组(P<0.05)。TLR4(-/-)CCI组p ERK1/2的表达水平亦明显低于TLR4(+/+)CCI组(P<0.05)。TLR4(-/-)CCI组p NF-κB p65的表达水平亦明显低于TLR4(+/+)CCI组(P<0.05)。与sham组相比,TLR4(+/+)CCI组与TLR4(-/-)CCI组在伤后24h,RAC-1的活性均明显升高(P<0.01)。TLR4(-/-)CCI组RAC-1的活性明显高于TLR4(+/+)CCI组(P<0.05)。同时,TLR4(-/-)CCI组AKT的激活明显高于TLR4(+/+)CCI组(P<0.05)。结论在创伤性颅脑损伤中,TLR4的激活下游的Myd88依赖信号通路,进而启动ERK1/2的磷酸化及NF-κB p65的激活,导致NF-κB p65转入核内,启动炎症因子的转录,激活与促进炎症反应。同时,TLR4的激活抑制了RAC-1的活性,从而抑制了可能具有保护作用的PI3K/AKT信号通路。