肾细胞癌(RCC)目前占大约每年所有新发成人恶性肿瘤的3%,而且其发病率在过去的二十年中一直呈现不断上升的趋势。因此,为了更好的控制肿瘤、治疗患者,研究者需要找到更加理想的特异性靶点,对肿瘤进行有效的治疗。新的靶点不仅能够对肿瘤进行早期诊断,也能有助于对肿瘤更早的进行干预和治疗。在关于肾癌的病理研究表明,90%的患者为肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,CCRCC)或者乳头状肾癌(papillary renal cell carcinoma,PRCC)。肾透明细胞癌作为最为重要的肾癌类型之一,对其进行深入的研究分析显得十分重要。microRNA(miRNA)是小的非编码RNA,在调节基因表达中发挥重要作用,并参与各种细胞的生物学过程,包括癌症的发生发展。几项关于肾细胞癌的研究都发现,micro RNA表达在肾癌的发展中发挥了重要的作用,而且与肿瘤预后具有明显的关系。mi R-630是近年来新发现的microRNA之一,在许多肿瘤中都发现了其表达上调。但是miR-630是否在肾癌组织中存在表达,以及其表达是否与肾癌细胞的生物学行为有关系,是否与肾癌的临床分期、肿瘤预后存在相关性,还不得而知。第一部分miR-630在肾透明细胞癌组织中表达及其与临床病理相关性的研究目的:通过分析肾透明细胞癌组织中mi R-630的表达水平与患者临床分期、肿瘤分级和预后的关系,探讨mi R-630在肾透明细胞癌生物学行为中发挥的作用。方法:实时定量荧光PCR法检测肾透明细胞癌组织中miR-630的表达,分析其与患者临床生物学行为的关系:1 HE染色法确认实验纳入标准:诊断为肾细胞癌,未接受任何辅助治疗。肾癌根治性切除术后肾癌组织标本及癌旁肾组织标本,经HE染色后组织形态学观察确认为肾透明细胞癌及切缘阴性的非癌组织。2实时定量荧光PCR法检测miR-630表达水平:设计针对miR-630的特异性引物,通过实时定量荧光pcr方法,检测实验组织中的mir-630表达水平。3mir-630表达水平与患者临床病理参数及预后的关系:mir-630表达水平与肾透明细胞癌患者临床病理参数之间的关系采用mann–whitneyu和kruskal–wallis检验,mir-630表达水平与患者预后之间的关系采用kaplan–meier进行检验,采用cox法进行多参数的回归性分析,本研究采用cox比例风险回归分析模型(coxproportionalhazardsmodel),此方法适用于当自变量为两个以上或者自变量为连续变量的情况。结果:1肾透明细胞癌组织和癌旁组织中提取细胞总rna,并检测后确认提取的rna的a260/280的od值的比值均在2左右,实时定量荧光pcr检测结果显示:癌组织中mir-630表达水平为7.36±1.27;癌旁组织中mir-630表达水平为2.86±0.57。统计学分析结果表明,癌组织的mir-630表达水平明显高于相应的癌旁组织(p<0.05)。2高肿瘤病理分级的患者(iii-iv级)mir-630表达水平明显高于低肿瘤病理分级(i-ii级)患者(p=0.001);淋巴转移阳性的患者肾癌组织中mir-630表达水平明显高于淋巴结转移阴性患者的mir-630表达水平(p=0.015);存在远处转移患者的肾癌组织mir-630表达水平明显高于远处转移为阴性的患者(p=0.004)。但是研究分析也发现,高临床病理分期患者(t3-t4)的mir-630水平与低临床病理分期患者(t1-t2)相比,二者之间并没有明显差别(p=0.717)。此外在不同性别、年龄段相比,mir-630表达水平也没有明显差别。3采用kaplan-meier方法,单变量生存分析研究结果表明,患者的淋巴结转移情况(rr=5.108,p=0.015)、肿瘤远处转移阳性情况(rr=5.979,p=0.004)、肿瘤病理分级(rr=3.264,p<0.001)与患者术后预后生存有明显的相关性。而且,mir-630表达与患者预后具有明显相关性(rr=3.378,p=0.008)。4患者术后生存曲线与肾癌组织的mir-630表达水平分析表明:mir-630为肾透明细胞癌的预后独立危险因素(rr=3.021,ci=2.074-5.726,p=0.016)。患者的肿瘤淋巴结转移(rr=3.681,ci=2.171-4.472,p=0.031)、病理分级(rr=2.781,ci=1.876-4.638,p=0.006)及肿瘤的远处转移(rr=3.936,ci=2.074-5.726,p=0.016)同样为患者术后生存的独立危险因素。第二部分肾癌细胞系及肾小管上皮细胞中mir-630表达水平的检测目的:比较mir-630在肾癌细胞中与正常肾小管细胞中的表达水平,分析mir-630在各个不同肾癌细胞系中是否存在表达差异。方法:分别体外培养肾癌细胞系786-o,achn,caki-1和caki-2,以及正常肾近端小管上皮细胞系hk-2。通过实时定量荧光pcr技术,检测各个细胞系中的mir-630表达水平。结果:分别提取正常肾近曲小管细胞系hk-2和肾癌细胞系786-o,achn,caki-1和caki-2的细胞内总rna,然后反转录为cdna。采用人特异性的mir-630引物,应用实时荧光定量pcr检测后发现,肾癌细胞系中的mir-630表达水平均高于正常肾小管上皮细胞系hk-2的mir-630表达水平(p<0.05),但是不同的肾细胞癌细胞系(786-o,achn,caki-1和caki-2)之间,mir-630表达水平未见明显差异(p>0.05)。第三部分抑制mir-630对肾癌786-o细胞生长、侵袭和凋亡的影响目的:通过肾癌细胞系的体外实验,进一步分析和证实mir-630对肾癌细胞生长、侵袭和凋亡方面的影响。方法:1mtt法检测细胞生长:体外培养肾癌细胞系786-o,然后用mir-630的anti-mir-630转染786-o细胞,并采用阴性sirna转染的细胞作为对照。转染96小时后,采用mtt法测定转染细胞的生长曲线,阴性转染的细胞作为对照。2流式细胞术检测细胞凋亡:肾癌细胞系786-o转染anti-mir-630,同样阴性转染作为对照,转染48小时后,收集细胞,采用annexinv-egfp和propidiumiodide染色,染色后采用流式细胞仪进行分析,检测细胞凋亡情况。3细胞划痕实验:肾癌细胞系786-o转染mir-630的anti-mir-630抑制其表达,然后将细胞种植于培养板内,待细胞长满后,进行划痕,然后每天观察细胞生长迁移情况,以评估mir-630表达阳性和mir-630表达抑制的癌细胞迁移差别的情况。4细胞侵袭性分析:肾癌细胞系786-o转染anti-mir-630抑制mir-630表达后,将细胞置于transwell小室上层,继续培养48小时后,显微镜下观察穿过小室的细胞数,并将转染阴性对照sirna的肾癌细胞作为对照,分析细胞的侵袭能力和mir-630对细胞侵袭行为的影响。结果:肾癌细胞786-o转染抑制mir-630表达anti-mir-630后,实时荧光定量pcr检测结果表明,细胞内的mir-630表达水平明显低于转染阴性对照sirna的细胞;进一步体外实验结果显示:1细胞生长情况:转染mir-630抑制anti-mir-630的786-o细胞的生长明显小于只做阴性转染的细胞,二者之间差别具有统计学意义(p<0.05)。2细胞迁移情况:采用细胞划痕实验分析mir-630对786-o细胞的迁移作用,研究发现,在转染mir-630的anti-mir-630后,细胞内的mir-630表达明显受到了抑制,细胞48小时的迁移情况分析则表明,在mir-630受到抑制后,786-o细胞迁移率明显下降,表明mir-630对细胞迁移具有促进作用。3细胞侵袭情况:采用transwell小室对肾癌786-o细胞的侵袭性进行分析,结果发现mir-630表达受到抑制的实验组的迁移的细胞明显少于阴性对照组(p<0.05),mir-630表达下调后,细胞侵袭性相应下降。4细胞凋亡检测:对肾癌786-o细胞的凋亡相关蛋白进行染色,然后采用流式细胞仪凋亡技术检测分析后发现,转染mir-630的anti-mir-630的786-o细胞的凋亡率明显高于阴性对照组的786-o细胞(p<0.05)。第四部分肾透明细胞癌mir-630靶基因预测、筛选与验证目的:预测mir-630的靶基因,并从中筛查与肾癌有关的基因为目的基因,并初步探讨其功能。方法:1利用生物信息软件预测mir-630的靶基因,结果进行keggpathway富集分析,结合靶基因在生物信息软件中的分值进行筛选。2利用脂质体转染技术在肾癌细胞786-o细胞中建立mir-630过表达及抑制表达模型。3利用实时定量pcr技术和western-blot及fcm技术检测细胞模型中的mir-630与靶基因的表达水平的相关性及其功能。结果:1使用常用数据库对靶基因进行预测,并通过实时定量pcr检测筛选靶基因,发现mir-630mimics作用后,其中rasgrf1、cdc14a两个基因有明显的下降,差异具有统计学意义(p<0.01);mir-630inhibitor作用后升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。2western-blot检测细胞转染后rasgrf1、cdc14a的蛋白表达,显示转染了mir-630mimics的786-o细胞中的rasgrf1与cdc14a蛋白表达量较阴性对照组、空白对照组显著下降,差异具有统计学意义(p<0.01);转染了mir-630inhibitor的786-o细胞中的rasgrf1与cdc14a蛋白的表达量较阴性对照组和空白对照组升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。3流式检测mir-630和anti-mir-630组细胞周期变化,结果显示,mir-630mimics组g1期明显缩短,而g2、s期明显延长;mir-630mimicsinhibitor组g1期明显延长,而g2、s期明显缩短,因此表明转染mir-630mimicsinhibitor后细胞出现了g1期阻滞。结论:1肾透明细胞癌中mir-630的表达较癌旁组织明显升高,提示mir-630在肾透明细胞癌的发生发展中起到了重要的作用。2肾透明细胞癌组织内mir-630表达水平与病理组织学分级、淋巴结转移及远处转移灶有明显的相关性,因此推测mir-630与肾透明细胞癌的恶性程度及侵袭转移密切相关;mir-630高表达的肾透明细胞癌患者预后差,生存期更短,因此推测mir-630可能促进了肾透明细胞癌的恶性进展。3mir-630表达上调可能是肾细胞癌的一个常见现象,因此表明mir-630可能是肾癌的重要标志物之一;不同的肾癌细胞系mir-630表达水平没有明显差别,因此推测mir-630可能在肾癌细胞的一些基本的生物学行为中发挥重要作用。4mir-630高表达能够促进肾透明细胞癌细胞生长、抑制其凋亡、促进癌细胞侵袭转移,因此本研究认为mir-630是导致肾透明细胞癌进展的重要因素之一;anti-mir-630能够明显降低肾透明细胞癌mir-630表达水平,进而导致细胞凋亡、生长减慢、侵袭能力下降,因此推测mir-630可能是肾透明细胞癌的潜在的治疗靶点之一。5证实mi R-630和RASGRF1、CDC14A的靶向关系为明确肾透明细胞癌发病机制提供了新的理论依据,开拓了新的思路;mi R-630的表达量与RASGRF1和CDC14A蛋白的表达水平存在有负性关系;miR-630可能对RASGRF1、CDC14A具有负性调控作用,此作用关系进一步影响到肾透明细胞癌的细胞周期变化。综上所述,mi R-630在肾癌的发生发展中起了重要的作用,而且在作为肾癌的早期诊断的分子标志物,以及潜在的分子靶向治疗的靶标方面均具有非常重要的价值。