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黄芪是一种传统的中药材,具有补气养血、利水消肿等功效,随着黄芪用量逐渐加大,野生黄芪已供不应求,市面上大部分为种植黄芪。因此导致黄芪质量参差不齐,以假乱真、以次充好现象时有发生。本文利用黄芪正品与常见混伪品ITS序列的差异,设计特异性引物来鉴别黄芪的真伪,并在传统的PCR方法上,进行了改进,采用qPCR法,利用SYBR Green荧光染料,对黄芪正品和伪品进行鉴别。同时,根据《中国药典》中规定的方法,对黄芪甲苷的含量进行测定,根据含量的差异验证分子生物学方法的准确性。并得出不同产地、剂型、炮制方式的黄芪样品中黄芪甲苷含量的规律,为进一步规范药材的种植提供依据。主要结果如下:1.利用ITS引物扩增黄芪样品和黄芪伪品,通过对二者的ITS序列进行分析、比对,找出存在差异的区域,并利用Primer5软件设计了鉴别黄芪的特异性引物,命名为HQ-F/HQ-R,长度分别为20/21 bp,扩增产物长度为524 bp。利用该引物对黄芪正品与伪品及近源物种进行扩增,并且设置退火温度梯度。结果发现,在退火温度为58℃时,黄芪正品在500-700之间有单一、清晰的条带,而其他样品在相应位置无条带,因此,选择58℃为最佳退火温度。2.购买黄芪样品23份,其中包括膜荚黄芪、蒙古黄芪、黄芪配方颗粒、炙黄芪,利用引物HQ-F/HQ-R对样品进行扩增,退火温度为58℃。采用普通PCR方法和SYBR Green染料法,从特异性、灵敏度、覆盖性等方面作了考察。结果发现,两种方法引物的特异性均较好,除正品外,其他均无扩增条带(曲线);不同产地、剂型、加工方式的黄芪样品,使用两种方法均可获得单一的扩增条带(曲线);对样品10倍比梯度稀释,每个稀释级做3个重复,然后扩增发现,普通PCR的检出限可达到10 mg/kg,而SYBR Green染料法检出限可达1 mg/kg,因此SYBR Green染料法的灵敏度较高。同时,通过SYBR Green法可实现扩增产物的相对定量。3.对实验材料中的黄芪样品,按照《中国药典》(2015版)中规定的HPLC-ELSD法,提取黄芪甲苷并检测其含量,根据不同样品黄芪甲苷的含量来验证前期分子生物学鉴别方法的可靠性、准确性。结果表明,黄芪正品中除四川理塘县产黄芪外,其他样品黄芪甲苷含量均符合限量要求;而非黄芪样品中黄芪甲苷含量均低于最低限度,所得结果与分子生物学鉴别结果一致。同时得出:不同产地、剂型的黄芪中黄芪甲苷的含量存在很大差异,其中,含量排名前四的分别为:甘肃定西、山西浑源、宁夏六盘山、黑龙江,而含量最少的为四川理塘县产黄芪。