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三磷酸腺苷(Adenosine 5’-triphosphate,ATP)不但分布在细胞内部,而且广泛存在于动物和植物细胞的细胞外基质中。细胞外ATP(extracellular ATP)可以作为一种信号分子,与细胞膜表面相应的特异性受体结合并激发细胞内的第二信使(Ca2+、H2O2、NO等),从而调节细胞的多种生理反应。水杨酸(Salicylic acid,SA)是植物最为重要的信号分子之一,其调节作用主要在以下两方面得到了体现:1)水杨酸一定水平的上升是诱导植物对病毒和病原菌抗病性的重要信号;2)较高水平的水杨酸的产生能够引发细胞程序性死亡,是一些生物和非生物因素(如病原菌侵染、臭氧处理和盐胁迫等)诱导细胞程序性死亡反应的关键环节。我们以烟草((Nicotiana tabacum L.BY-2)悬浮细胞为实验材料,研究了胞外ATP在水杨酸调节的植物细胞死亡和呼吸中扮演的角色。主要实验发现:(1)实验采用不同浓度(0μmol、100μmol、300μmol、500μmol、700μmol)的SA处理烟草悬浮细胞,明显导致了烟草BY-2细胞死亡;随着SA浓度的升高,细胞死亡率也是不断加剧,并且随着处理时间的延长,细胞死亡率也在不断提升。使用荧光素二乙酸脂(Fluorescein diacetate,FDA)染色检测SA处理后烟草悬浮细胞活性时,同样发现随着SA浓度和处理时间的增加,细胞的荧光强度减弱。(2)实验中主要研究了500μmolSA处理10h的烟草悬浮细胞呼吸以及胞内、外的ATP变化。实验发现SA处理后除了导致细胞死亡以外,同时导致了细胞呼吸的严重抑制,胞内外ATP含量的下降。这些结果说明在呼吸底物不变的情况,SA对于烟草BY-2细胞线粒体呼吸具有即时的直接抑制作用。而SA处理对细胞呼吸及细胞色素途径呼吸的直接抑制作用不可避免的导致了胞内ATP(i ATP)含量的下降,同时导致了胞外ATP(eATP)的下降。(3)采用AMP-PCP(β,γ-methyleneadenosine 5’-triphosphate,ATP竞争性抑制剂)处理烟草悬浮细胞,发现同样也可以导致细胞死亡。但通过使用添加外援ATP能够显著缓解SA对细胞的死亡和呼吸抑制,由此我们认为有可能外源的ATP可以抑制SA处理导致的细胞中ATP损耗的发生,进而明显缓解SA诱导的细胞死亡的下降。这个结果表明SA处理所诱导诱导烟草BY-2细胞死亡和呼吸的下降过程中eATP在起至关重要的作用。(4)为了进一步探索eATP在调节SA诱导的烟草悬浮细胞死亡和呼吸的内在机理,实验中使用了Ca2+抑制剂EGTA(Ethylene glycol tetraacetic acid,Ca2+螯合剂)和GdCl3(Gadoliniumchloride,Ca 2+通道抑制剂)以及外源单独添加Ca 2+。结果显示,添加了抑制剂之后ATP对SA导致的烟草悬浮细胞活力和呼吸作用的缓解作用消失,同时加入外源Ca 2+同样可以缓解SA诱导细胞的死亡和呼吸抑制,单独添加外源物质对细胞无影响。这个结果表明eATP对于SA诱导细胞死亡和呼吸的调节依赖于细胞中Ca 2+。上述研究结果表明,细胞的死亡和呼吸的下降是与e ATP下降存在某种内在联系,SA诱导的细胞死亡是由于水杨酸的抑制线粒体呼吸,减少了胞内ATP的生产,同时造成了胞外ATP的减少;通过外源添加eATP,增加了胞内Ca2+水平,进而缓解SA诱导的细胞死亡、呼吸抑制,以及胞内ATP的合成,由此缓解烟草悬浮细胞死亡。