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目的通过观察荷瘤小鼠二次接种肿瘤细胞后的生存期、肿瘤生长情况、血清细胞因子Tumor necrosis factor-α(TNF-α)和Interferon-γ(IFN-γ)的含量,来分析冷冻及免疫治疗的抗肿瘤疗效,为临床双原发、多原发肿瘤、转移瘤患者冷冻联合免疫治疗提供实验基础及理论依据。方法选用18～22g昆明小鼠160只接种S180肉瘤细胞后,随机分为四组,对肿瘤分别进行冷冻治疗(A组)、免疫治疗(B组)、冷冻+免疫治疗(C组)及生理盐水对照(D组),治疗结束后第10天,将每组小鼠再随机分成两组,每组20只,共8组,分别二次接种小鼠S180肉瘤细胞和小鼠H22肝癌细胞,通过观察荷瘤小鼠的生存期、肿瘤生长情况、检测血清细胞因子TNF-α、IFN-γ的含量来评价不同治疗方法的抗肿瘤疗效。结果1初次接种S180肉瘤细胞的小鼠,经过冷冻、免疫治疗后,冷冻治疗组有1例治愈(1/40),冷冻+免疫治疗组有1例治愈(1/40)。2肿瘤细胞二次接种后荷瘤后小鼠的生存期2.1二次接种S180肉瘤细胞后小鼠的生存期(天)A组小鼠的平均生存期为:91.3±6.83,B组为:92.5±10.51,C组为:114.4±9.08,D组为:59.7±9.17。A组、B组、C组小鼠的平均生存期均较D组明显延长,与D组相比,组间均有显著性差异(P<0.01);B组小鼠的平均生存期较A组长,但组间比较无显著性差异(P>0.05);C组小鼠的平均生存期较A组长,组间比较有显著性差异(P<0.01);C组小鼠的平均生存期较B组长,组间比较有显著性差异(P<0.01)。结果表明:通过冷冻治疗、免疫治疗、冷冻联合免疫治疗均可以有效提高荷瘤小鼠抵抗同种肿瘤细胞再次攻击的能力,延长小鼠的生存期。而冷冻联合免疫治疗效果更好。2.2二次接种H22肝癌细胞后小鼠的生存期(天)A组小鼠的平均生存期为:44.6±4.45,B组为:55.5±3.98,C组为:72.1±5.74,D组为:42.3±6.67。B组、C组小鼠的平均生存期均较D组小鼠延长,组间比较具有显著性差异(P<0.01);A组小鼠的平均生存期较D组小鼠延长,但组间比较无显著性差异(P>0.05);B组小鼠的平均生存期较A组长,组间比较有显著性差异(P<0.01);C组小鼠的平均生存期较A组长,组间比较有显著性差异(P<0.01);C组的小鼠平均生存期较B组长,组间比较有显著性差异(P<0.01)。结果表明:通过冷冻治疗、免疫治疗、冷冻联合免疫治疗均可提高荷瘤小鼠抵抗异种肿瘤细胞攻击的能力,延长小鼠的生存期,而冷冻联合免疫治疗效果好,单纯冷冻治疗的效果差。3荷瘤小鼠二次接种瘤细胞后肿瘤的生长情况3.1荷瘤小鼠二次接种S180肉瘤细胞后肿瘤生长情况二次接种S180肉瘤细胞后,A组、B组、D组小鼠左后肢腋部皮下均有肿瘤生长,C组2例小鼠未见肿瘤生长。A组小鼠的平均瘤体重量(g)为:0.541±0.0696,抑瘤率为:51.44%;B组小鼠的平均瘤体重量(g)为:0.507±0.0801,抑瘤率为:54.49%;C组小鼠的平均瘤体重量(g)为:0.164±0.1071,抑瘤率为:85.29%;D组小鼠的平均瘤体重量(g)为:1.114±0.1524。A组、B组、C组小鼠的平均瘤体重量均较D组小鼠的平均瘤体重量轻,组间比较具有显著性差异(P<0.01);B组小鼠的平均瘤体重量较A组轻,但组间比较无显著性差异(P>0.05);C组小鼠的平均瘤体重量较A组轻,组间比较具有显著性差异(P<0.01);C组小鼠的平均瘤体重量较B组轻,组间比较具有显著性差异(P<0.01)。结果表明:通过冷冻治疗、免疫治疗、冷冻联合免疫治疗,荷瘤小鼠对二次接种的同种肿瘤细胞生长均有一定的抑制作用,而冷冻联合免疫治疗效果更好。3.2荷瘤小鼠二次接种H22肝癌细胞后肿瘤生长情况二次接种H22肝癌细胞后,四组均有肿瘤生长。A组小鼠的平均瘤体重量(g)为:1.331±0.1264,抑瘤率为:7.51%;B组小鼠的平均瘤体重量(g)为:1.436±0.1639,抑瘤率为:0.21%;C组小鼠的平均瘤体重量(g)为:0.921±0.1007,抑瘤率为:36.00%;D组小鼠的平均瘤体重量(g)为:1.439±0.2045。C组小鼠的平均瘤体重量较D组轻,组间比较具有显著性差异(P<0.01);A组、B组小鼠的平均瘤体重量较D组轻,但组间比较无显著性差异(P>0.05);A组小鼠的平均瘤体重量较B组轻,但组间比较无显著差异(P>0.05);C组小鼠的平均瘤体重量较A组轻,组间比较具有显著性差异(P<0.01);C组小鼠的平均瘤体重量较B组轻,组间比较具有显著性差异(P<0.01)。结果表明:通过冷冻联合免疫治疗后,荷瘤小鼠对二次接种的异种肿瘤细胞生长有一定抑制作用。而通过单纯冷冻治疗、免疫治疗后,荷瘤小鼠对二次接种的异种肿瘤细胞生长未见明显抑制作用。4荷瘤小鼠二次接种肿瘤细胞后血清INF-γ的含量情况4.1荷瘤小鼠二次接种S180肉瘤细胞后血清INF-γ的含量情况(pg/ml)A组小鼠血清INF-γ的平均含量为:11.231±1.466,B组为:12.042±2.420,C组为:18.163±3.347,D组为:4.871±2.279。A组、B组、C组小鼠血清INF-γ的平均含量均较D组高,组间比较均具有显著性差异(P<0.01);B组小鼠血清INF-γ的平均含量较A组高,但组间比较无显著性差异(P>0.05);C组小鼠血清INF-γ的平均含量较A组高,组间比较具有显著性差异(P<0.01);C组小鼠血清INF-γ的平均含量较B组高,组间比较具有显著性差异(P<0.01)。结果表明:对荷瘤小鼠分别进行冷冻治疗、免疫治疗、冷冻联合免疫治疗后,二次接种同种肿瘤细胞,荷瘤小鼠血清INF-γ的平均含量均较对照组高,冷冻联合免疫治疗效果更明显。4.2荷瘤小鼠二次接种H22肝癌细胞后血清INF-γ的含量情况(pg/ml)A组小鼠血清INF-γ的平均含量为:9.171±1.443,B组为:9.448±1.639,C组为:13.096±1.618,D组为:4.506±1.968。A组、B组、C组小鼠血清INF-γ的平均含量均较D组高,组间比较均具有显著性差异(P<0.01);B组小鼠血清INF-γ的平均含量较A组高,但组间比较无显著性差异(P>0.05);C组小鼠血清INF-γ的平均含量较A组高,组间比较具有显著性差异(P<0.01);C组小鼠血清INF-γ的平均含量较B组高,组间比较具有显著性差异(P<0.01)。结果表明:对荷瘤小鼠分别进行冷冻治疗、免疫治疗、冷冻联合免疫治疗后,二次接种异种肿瘤细胞,荷瘤小鼠血清INF-γ的平均含量均高于对照组,冷冻联合免疫治疗效果更明显。5荷瘤小鼠二次接种肿瘤细胞后血清TNF-α的含量情况5.1荷瘤小鼠二次接种小鼠S180肉瘤细胞后血清TNF-α的含量情况(pg/ml)A组小鼠血清TNF-α的平均含量为:6.674±0.958,B组为:8.118±0.835,C组为:10.043±0.762,D组为:4.661±0.463。A组、B组、C组小鼠血清TNF-α的平均含量均较D组高,组间比较均具有显著性差异(P <0.01);B组小鼠血清TNF-α的平均含量较A组高,组间比较具有显著性差异(P<0.01),C组小鼠血清TNF-α的平均含量较A组高,组间比较具有显著性差异(P<0.01);C组小鼠血清TNF-α的平均含量较B组高,组间比较具有显著性差异(P<0.01)。结果表明:对荷瘤小鼠分别进行冷冻治疗、免疫治疗、冷冻联合免疫治疗后,二次接种同种肿瘤细胞,荷瘤小鼠血清TNF-α的平均含量均高于对照组,冷冻联合免疫治疗后效果更明显。5.2荷瘤小鼠二次接种小鼠H22肝癌细胞后血清TNF-α的含量情况(pg/ml)A组小鼠血清TNF-α的平均含量平均为:8.810±0.673,B组为:9.231±0.861,C组为:11.789±1.079,D组为:5.196±1.855。A组、B组、C组小鼠血清TNF-α的平均含量均较D组高,组间比较均具有显著性差异(P<0.01);B组小鼠血清TNF-α的平均含量较A组高,但组间比较无显著性差异(P>0.05);C组小鼠血清TNF-α的平均含量较A组高,组间比较具有显著性差异(P<0.01);C组血清TNF-α的平均含量较B组高,组间比较具有显著性差异(P<0.01)。结果表明:对荷瘤小鼠分别进行冷冻治疗、免疫治疗、冷冻联合免疫治疗后,二次接种异种肿瘤细胞,荷瘤小鼠血清TNF-α的平均含量均高于对照组,冷冻联合免疫治疗后效果更明显。结论1小鼠S180肉瘤通过单纯冷冻治疗后,有一定治愈率,并能延长小鼠的生存期。2冷冻治疗小鼠S180肉瘤后,可以提高小鼠机体抗肿瘤免疫,有效控制了同种肿瘤细胞二次接种后肿瘤的发展,抑制了肿瘤的生长,延长了荷瘤小鼠的生存期。一定程度上控制了异种肿瘤细胞二次接种后肿瘤的生长,延长了荷瘤小鼠的生存期。3白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)腹腔注射可以提高荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫,有效抑制了同种肿瘤细胞二次接种后肿瘤的生长,延长了荷瘤小鼠的生存期。一定程度上抑制了异种肿瘤细胞的二次接种后肿瘤的生长,延长了荷瘤小鼠的生存期。4围冷冻手术期配合IL-2协同治疗,有效的提高了同种和异种肿瘤细胞二次接种后荷瘤小鼠血清细胞因子的含量,增强了机体的抗肿瘤免疫,荷瘤小鼠的生存期、肿瘤抑制率明显高于单纯冷冻和单纯免疫治疗。5通过本研究可以看出冷冻直接杀伤单一恶性肿瘤后,在围冷冻期配合IL-2治疗,可以更好的激活、活化肿瘤患者的免疫系统,对于同种及异种肿瘤发挥有效的抗肿瘤作用。为临床多发转移瘤、双原发及多原发肿瘤的治疗提供了实验基础。