【摘 要】
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目的:本研究通过构建左心疾病相关性肺动脉高压（Pulmonary hypertension due to left heart disease,PH-LHD）大鼠模型,并对离体肺静脉进行机械牵张。观察白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）在肺静脉中的表达及其是否通过丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-a
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目的:本研究通过构建左心疾病相关性肺动脉高压（Pulmonary hypertension due to left heart disease,PH-LHD）大鼠模型,并对离体肺静脉进行机械牵张。观察白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）在肺静脉中的表达及其是否通过丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activation protein kinase,MAPKs）信号通路进行转导,探讨肺静脉在PH-LHD疾病早期的改变和参与肺血管重构的可能机制;通过改良肺静脉提取方法进行肺静脉平滑肌细胞（Pulmonary vein smooth muscle cells,PVSMCs）原代培养,为后续细胞水平研究建立基础。方法:选取66只清洁级雄性SD大鼠,通过完全随机设计分为假手术组（S1、S2组,S3,n=6）、PH-LHD模型组（M1～M7组,n=6）和PVSMCs模型组（M8组,n=6）。假手术组均行假手术处理,PH-LHD模型组与PVSMCs模型组均通过Banding手术建立模型,术后25天、35天分别制备相应肺静脉、肺动脉及肺组织样本。1、其中S1、S2的肺静脉分别采用0 g、2.0 g的机械张力牵张60分钟;2、M1、M2的肺静脉分别采用0 g、2.0 g的机械张力牵张60分钟;3、M3～M6的肺静脉先分别用相应的SAC/MAPKs信号通路抑制剂预处理60分钟后,再以2.0 g机械张力牵张60分钟;4、M8大鼠在静脉穿刺针套管引导下分离肺静脉,用组织块贴壁法培养原代肺静脉平滑肌细胞,使用差速贴壁法20分钟纯化细胞。通过组织学、血清测定、蛋白表达检测观察肺静脉MAPKs信号通路和IL-6、TNF-α表达;通过免疫组化染色鉴定PVSMCs细胞纯度。结果:1、建立PH-LHD大鼠疾病早期模型（1）术后25天,心脏彩超显示PH-LHD组大鼠出现左心衰竭表现;（2）PH-LHD组大鼠与假手术组相比,左心重量、右心室压、左心房压均出现增高;（3）假手术组和PH-LHD组大鼠肺组织HE染色未见明显形态学差异。2、PH-LHD大鼠疾病早期肺静脉、动脉、组织中IL-6、TNF-α表达比较（1）术后25天,ELISA结果显示,PH-LHD组大鼠血清中IL-6、TNF-α表达高于假手术组。（2）术后25天,肺组织免疫组化结果显示,肺静脉周围IL-6、TNF-α表达高于肺动脉与肺组织,假手术组无此现象;肺静脉血管环免疫组化结果显示,PH-LHD组IL-6、TNF-α表达高于假手术组;术后35天,假手术组和PH-LHD组大鼠肺组织中,肺静脉血管、肺动脉血管、肺组织IL-6、TNF-α均出现增高。（3）术后25天,Western blot结果显示,PH-LHD组大鼠肺静脉中IL-6、TNF-α表达高于肺动脉与肺组织;术后35天,PH-LHD组大鼠肺静脉、肺动脉、肺组织均出现IL-6、TNF-α表达增高。3、PH-LHD大鼠疾病早期肺静脉IL-6、TNF-α表达升高,且被SAC/MAPKs信号通路抑制剂拮抗。（1）Western blot结果显示,S1、S2的肺静脉IL-6和TNF-α表达无明显差异;M1组的IL-6和TNF-α表达高于S1和S2,并且低于M2。（2）在M3、M4、M5、M6肺静脉中的IL-6、TNF-α的表达较M2减少。4、机械牵张诱导PH-LHD大鼠肺静脉MAPKs信号通道蛋白表达升高,且被SAC/MAPKs信号通路抑制剂拮抗。（1）术后25天,Western blot结果显示,S1、S2的p-p38、p-JNK1、p-ERK1/2通道蛋白表达无明显差异。M1的p-p38、p-JNK1、p-ERK1/2通道蛋白表达高于S1、S2,并且低于M2。（2）M3、M4、M5、M6肺静脉中的p-p38、p-JNK1、p-ERK1/2的蛋白表达较M2减少。5、肺静脉平滑肌细胞原代培养使用肺静脉组织块贴壁法培养PVSMCs,1～2天出现细胞。免疫组化结果显示,培养的第三代PVSMCs细胞形态完整,胞核清晰可见,平滑肌细胞特异性抗原α-SMA免疫组化阳性率为90%以上,细胞纯度较高。结论1、PH-LHD疾病早期,肺静脉即出现IL-6和TNF-α的升高趋势,早于肺动脉与肺组织,且升高趋势被SAC/MAPKs抑制剂拮抗;同时肺静脉出现MAPKs信号通道蛋白表达升高趋势。PH-LHD大鼠模型中,机械牵张肺静脉可能通过SAC/MAPKs信号通路介导炎症因子IL-6和TNF-α表达升高,参与肺动脉高压形成。2、PVSMCs原代培养时,使用静脉穿刺针套管引导可降低肺静脉分离难度,差速贴壁法纯化后可以得到增殖能力强、纯度高的PVSMCs。
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