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能源危机和化石燃料消耗带来的环境污染是当今社会发展所面临的重大难题,寻找清洁的可再生新能源是解决这些问题的最有效的方法。纤维素作为自然界含量最丰富的可再生的生物质资源,有效利用也能够为人类提供巨大的能源。纤维素酶可将纤维素的降解成简单糖并进一步通过生物技术转化成为乙醇、甲烷等能源物质。因此纤维素酶的开发是纤维素有效利用的关键环节。纤维素酶的来源十分广泛,不仅可以由微生物(细菌、真菌、放线菌)、植物产生,甚至一些动物也可以产生内源性的的纤维素酶。动物纤维素酶的研究起步较晚,从1998年首次克隆到动物内源性纤维素酶基因,至今虽然己知的动物内源性纤维素酶基因在不断的增加,但是动物内源性纤维素酶的异源表达一直是研究的难点。2010年Hirayama etal在Aspergillus oryzae表达了两种白蚁的纤维素酶RsEG和NtEG,两种纤维素酶的表达量分别为26mg/L、31mg/L,是迄今为止表达量最高的。本实验室前期工作中,从福寿螺中分离到一种纤维素酶EG27,该酶具有较好的温度和pH稳定性(在pH3-11范围内具有良好的稳定性,60℃保温24小时仍保留了85%的酶活力),具有较好的工业应用前景。本文首先利用商品化载体pGAPZαA,通过分子生物学技术,构建了EG27的毕赤酵母重组表达菌株pGAPZaA-EG27/SMD1168.之后利用响应面分析法,对EG27表达培养基YPD的三种基本营养成分Tryptone、Yeast extract、D-gulucose进行了优化,确定了适用于该重组菌株的EG27的最佳表达培养基条件,即蛋白胨30g/L,酵母膏60.9g/L,葡萄糖30.9g/L,得到模型预测的EG27的最大产量为353.592U/L。此外,在商品化载体pGAPZaA的基础上,对其进行了一些改造,在起始密码子前添加了一段可以增强真核基因表达水平的kozak序列,同时,用里氏木霉的疏水球蛋白HFBⅡ的分泌信号肽替换载体本身的a-factor分泌信号肽,得到新载体pGAPH。之后将PCR扩增得到的目的基因片段连接到表达载体pGAPH中,经DH5α亚克隆后,转入毕赤酵母SMD1163基因组中进行表达。构建的重组表达菌株pGAPH-EG27/SMD1163经发酵培养后,EG27最高表达量为54mg/L。取发酵上清,经超滤脱盐、阳离子交换层析和疏水层析后得到SDS-PAGE均一EG27。重组酶性质与野生酶相似,具有良好的温度稳定性与pH稳定性,为进一步的工业化扩大培养以及酶结构研究打下了基础。两种重组表达菌株摇瓶培养的后的菌液上清的Western-Blot结果表明,重组菌株pGAPH-EG27/SMD1163的分泌表达能力较重组菌株pGAPZaA-EG27/SMD1168高出5倍多。