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肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）是一种人体自分泌的蛋白。其能特异性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显细胞毒作用,因而被视为一种极有潜力的抗肿瘤蛋白药物,具有广泛的应用价值。然而在TRAIL的实际应用过程中,某些肿瘤被发现对其存在耐受;同时一些原本对其敏感的肿瘤在长期TRAIL处理后也可能产生获得性耐受。这些原因使得TRAIL在实际临床应用中受到了限制。目前肿瘤细胞对TRAIL耐受的机制主要包括:TRAIL受体表达、分布等的异常;肿瘤细胞内凋亡相关因子的失常;TRAIL在激活促凋亡通路的同时也激活一些促存活信号通路,如 NF-κB、MAPK、PI3K/AKT、STAT 通路。实验目的:结合目前对TRAIL耐受机制的研究,本课题拟从抑制TRAIL激活的促存活信号通路NF-κB角度着手,尝试增强TRAIL抗肿瘤的活性。整个课题分为以下四个部分:1)NF-κB转录因子报告基因系统的构建及优化;2)利用该系统筛选能下调NF-κB表达量或抑制NF-κB活性的中药成分;3)将2)中筛选出的中药成分与TRAIL联用,检测其对A549、COLO205等肿瘤细胞的杀伤效果;4)对3)中中药成分促进TRAIL抗肿瘤活性机制进行初步探索。研究方法与结果:1.稳定表达NF-κB转录因子荧光素酶报告基因系统的构建及验证。利用分子克隆的酶切、连接等基本操作,先将逆转录病毒载体pQCXIP原有的CMV启动子去除,再分别插入NF-κB增强子序列以及荧光素酶NanoLuc（NLuc）报告基因序列,构建了受转录因子NF-κB调控的荧光素酶NLuc报告基因表达载体pQCXIP-NF-κB-NLuc。将构建的pQCXIP-NF-κB-NLuc质粒与病毒包装质粒pVSVG一起用阳离子脂质体法转染人胚肾上皮包装细胞GP2-293细胞系制备相应的逆转录病毒,侵染人宫颈癌细胞系HeLa,通过嘌呤霉素筛选出表达相应抗性基因的阳性细胞,并进一步筛选出对NF-κB通路阳性刺激物TNFα最敏感的细胞克隆。该细胞株对TNFα的刺激呈现出浓度梯度、时间依赖性,表明受NF-κB转录因子调控的稳定表达NLuc荧光素酶的细胞系PP-NF-κB-NLuc-HeLa构建成功,可用于定量检测NF-κB的活化效果及筛选与NF-κB活化调控相关的药物等。2.优化构建的荧光素酶报告基因系统检测方式。在上述构建好的荧光素酶报告基因系统的应用过程中发现培养基的pH、培养基中的血清对NLuc荧光素酶的检测有影响,对于后续药物调控功能的检测存在不利影响,因此在初步确定了 pH及血清的原因后,选取了 NLuc荧光素酶发光强度较强及相对稳定的添加0.03%（V/V）Triton X-100的PBS缓冲液（PBST）作为Nluc酶的检测体系。3.筛选下调NF-κB的中药成分。在成功完成了系统的构建及NLuc荧光素酶的检测体系优化后,利用该系统对36种中药粗提物或单体进行了检测,并初步筛选出了 12种能降低NF-κB活性或下调NF-κB表达量的中药粗提物或单体,在排除了有强细胞毒性的、有相关与TRAIL联用抗肿瘤报道的、促肿瘤增殖的成分等之后,最终选取了QD6-4、SKN两种中药单体进一步研究其与TRAIL的联用的效果。4.筛选到的中药单体与TRAIL联用对肿瘤的杀伤检测。细胞活力检测实验结果表明,两种单体分别与TRAIL联用作用于人肺癌细胞系A549及结直肠癌细胞系COLO205细胞后,QD6-4对这两个细胞系几乎无任何促进TRAIL抗肿瘤活性的作用,SKN对COLO205几乎无作用,但能显著增强TRAIL对A549的杀伤,且在SKN使用浓度为2-8μM时有协同效果。进一步的实验结果表明,SKN对人结直肠癌细胞系HCT116、人宫颈癌细胞系HeLa、人胰腺癌细胞系PANC-1细胞系也均表现出了促进TRAIL杀伤的效果,其中在使用浓度为2-8μM时对HeLa和PANC-1细胞的杀伤作用均表现出了协同效果,且对PANC-1细胞系的协同效果尤为明显。5.SKN与TRAIL协同诱导凋亡机制研究。本课题随后对SKN促进TRAIL抗肿瘤的机制进行了初步探讨,Annexin V-PI双染的结果表明,SKN可显著增强TRAIL对A549及PANC-1细胞系的凋亡诱导。Western blot检测结果表明,针对A549细胞,SKN与TRAIL联用组与空白组比较,Caspase 8和Caspase 3出现了明显的活化,而Caspase 9无明显变化,说明SKN与TRAIL联用主要是通过促进外源性凋亡途径而增强TRAIL的肿瘤杀伤效果的。另外,Western blot结果表明,SKN及SKN与TRAIL联用组p65蛋白的表达均有下调,SKN与TRAIL联用组抑凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL表达量均下调,而促凋亡蛋白Bax表达量几乎无变化,说明SKN对NF-κB的下调作用可能部分通过下调p65的表达量引起的,SKN促进TRAIL诱导A549等细胞的凋亡可能与抑制抑凋亡蛋白的表达相关。结论:1、本实验成功构建了稳定表达受NF-κB转录因子调控的NLuc荧光素酶报告基因系统,并优化了检测NLuc荧光素酶的检测方式。该系统可应用于检测对NF-κB有调控作用的成分。2、筛选出的SKN能促进TRAIL对A549、HCT116、PANC-1、HeLa细胞的杀伤作用,SKN对A549和PANC-1细胞的促TRAIL杀伤作用主要是通过凋亡的方式。3、SKN与TRAIL联用作用于A549细胞可活化Caspase 3和Caspase 8蛋白,对Caspase 9表达量几乎无影响。4、SKN与TRAIL联用作用于A549细胞可下调p65,抑凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL的表达量,对促凋亡蛋白Bax的表达量无明显影响。