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叶绿体是植物光合作用的主要场所,在此完成从光能到化学能能量的转换,对植物的生命活动起着重要作用。同时,叶绿体也是植物细胞所特有的半自主性细胞器,是叶绿素、脂类、淀粉和氨基酸的合成场所。与水稻叶绿体相关的突变体往往表现为叶色异常,叶绿素缺失。由于叶色突变相对容易获得、表型比较明显,目前已成功克隆出多个叶色相关基因,这类基因大部分为叶绿体发育调控或者编码叶绿素合成基因,其中也有部分参与了线粒体的发育调控。由于叶绿体发育调控涉及到很多不同的途径,包括色素合成途径,光受损蛋白降解,细胞器基因组DNA的合成与修复,线粒体与叶绿体相互协调等等,因此对这类突变体的研究将有助于我们加深对叶绿体发育这一复杂生物过程的了解。
本研究主要关注一个从水稻籼粳交F6代自然群体中发现的水稻白穗突变体wp3(whitepanicle3)。与大多数叶绿体发育相关突变体不同,wp3不仅在幼苗期和分蘖期基部抽出的前三至五片叶片含有白色条斑,更重要的是wp3的穗部也为奶白色。遗传分析表明wp3突变体的白穗性状受单隐性核基因控制,而其条斑叶的性状是通过细胞质遗传的。对wp3突变体的细胞学观察发现,wp3突变体中叶绿体偏小偏圆,内膜结构不清晰,缺少片层结构;并且在wp3每个细胞中叶绿体的数量也减少;叶绿体的发育明显受阻,在突变体白色部分的细胞中几乎观察不到发育的叶绿体。通过图位克隆的方法我们分离鉴定了WP3基因,进而对突变体的功能互补实验也证实了图位克隆的结果。然而值得注意的是,尽管WP3的功能互补实验能够互补突变体白穗的表型,但是在T0代却无法恢复突变体条斑叶的表型,这也从另一个方面证实了条斑叶性状的确是通过细胞质遗传的。
基因序列分析结果显示,WP3基因编码一个功能未知的蛋白,仅在N端有一个疏水结构域。同源区段序列比对结果发现,WP3基因仅在禾本科植物高梁,小米以及野生稻中有同源基因。RT-PCR与GUS染色结果显示,WP3基因主要在短于5mm的幼穗中表达,GUS结果还显示在长于5mm的穗子与根尖中也有少量表达。利用WP3:GFP融合蛋白进行WP3蛋白在水稻中的亚细胞定位研究,结合免疫印迹法证明WP3编码蛋白定位于线粒体中。利用透射显微镜对突变体幼穗中线粒体的形态结构进行观察,发现与野生型线粒体相比,在突变体幼穗中的线粒体基本呈圆形且直径略大于野生型,而野生型中线粒体形态则较为丰富,不仅有圆形还有短棒型,管状等等;此外野生型线粒体的内膜结构也相对清晰。进一步对细胞内各类形态的线粒体数目进行统计,发现野生型幼穗细胞中线粒体的数量略少于突变体幼穗细胞,但野生型幼穗细胞中呈棒状线粒体占总线粒体比例却远高于突变体幼穗细胞。同时,WP3基因突变也会影响一些到线粒体基因的表达,如AOX和CytC。这些结果暗示WP3基因可能参与到水稻线粒体的分裂与融合的过程。综上所述,我们的实验结果显示WP3基因对于维持植物线粒体功能是必须的,同时也暗示该基因在水稻穗部的叶绿体发育过程中发挥重要的作用。