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目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种神经退行性疾病,以进行性痴呆为主要临床表现,随着老龄化进程的加速,AD患病率逐年攀升,而目前对于AD尚无确切有效的治疗手段。AD的特征性病理变化包括以β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）异常沉积为核心的老年斑,tau蛋白超磷酸化形成的神经原纤维缠结和广泛的神经元缺失。外泌体可以透过血脑屏障调节神经元的形成、再生以及调节突触的功能,是近年来的研究热点。本研究拟探讨骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）外泌体对 AD 模型小鼠认知功能的改善及其作用机制。方法:1.BM-MSCs及外泌体的分离和鉴定:从6周龄C57BL/6小鼠的股骨和胫骨中吸出骨髓,分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞分析法检测CD29、CD44、CD34、CD45进行BM-MSCs的鉴定;利用试剂盒提取法从第三代BM-MSCs培养上清中获取BM-MSCs外泌体,分别进行电镜及蛋白CD9、CD63的鉴定。2.为明确外泌体对AD模型小鼠认知功能有无改善作用,将雌性APP/PS1双转基因小鼠（遗传背景C57BL/6）,与野生型（wild type,WT）雄性C57BL/6小鼠杂交,提取鼠尾DNA,PCR鉴定APP/PS1双转基因小鼠的基因表型。将7月龄小鼠分为三组:APP/PS1+外泌体组,APP/PS1+生理盐水组,同窝野生（wild type,WT）组,采用水迷宫实验检测小鼠的空间学习和记忆能力,酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测小鼠脑组织中 Aβ1-40 和Aβ1-42的水平。3.为研究外泌体在AD中的作用机制,将APP/PS1小鼠用外泌体联合SKⅠ-Ⅱ或VPC23019 进行处理,SKⅠ-Ⅱ 为鞘氨醇激酶（Sphingosine kinase,SphK）抑制剂,VPC23019 为鞘氨醇-1-磷酸-1（Sphingosine-1-phosphate receptor 1,S1P1）受体阻滞剂。将实验动物分为APP/PS1+外泌体组,APP/PS1+生理盐水组,APP/PS1+外泌体+SKⅠ-Ⅱ组,APP/PS1+外泌体+VPC23019组,同窝WT组共五组进行实验。WB检测小鼠脑组织中SphK1和S1P1的表达水平,水迷宫实验检测小鼠的空间学习和记忆能力,硫黄素S染色测定小鼠大脑皮层和海马中Aβ的分布和含量,免疫荧光分析检测神经元核蛋白（Neurona1 nuclear,NeuN）在小鼠大脑皮层和海马中的表达,ELISA检测小鼠脑组织中Aβ1-40和Aβ1-42的水平,蛋白质印迹法（Western blot,WB）检测小鼠脑组织中SphK1、S1P1以及β-分泌酶-1（β-site APP cleaving enzyme 1,BACE1）、早老素-1（Presenilin-1,PS1）、脑啡肽酶（Neprilysin,Nep）的表达。结果:1.BM-MSCs和外泌体的分离及鉴定从C57BL/6小鼠股骨和胫骨的骨髓中分离出BM-MSCs,其CD29和CD44水平显著升高,CD34和CD45无明显表达,这表明BM-MSCs已成功从C57BL/6小鼠中分离;进而将外泌体与BM-MSCs分离,用透射电子显微镜观察到外泌体呈双凹面圆盘状双层膜结构,纳米颗粒分析仪检测外泌体粒径平均值为113.2nm;WB评估外泌体表面标志物CD9和CD63的表达,与BM-MSCs相比,外泌体中CD9和CD63呈高表达。2.BM-MSCs外泌体改善APP/PS1小鼠认知功能在水迷宫试验中,APP/PS1+生理盐水组小鼠较WT组空间学习和记忆能力明显下降;APP/PS1+外泌体组较APP/PS1+生理盐水组小鼠空间学习和记忆能力显著改善。ELISA检测小鼠脑组织中Aβ1-40和Aβ1-42的水平,APP/PS1+盐水组小鼠脑组织中Aβ1-40和Aβ1-42的水平较WT组明显升高;APP/PS1+外泌体组小鼠脑组织中Aβ1-40和Aβ1-42水平较APP/PS1+生理盐水组显著降低。3.BM-MSCs外泌体通过激活SphK/S1P信号通路改善AD认知功能WB检测小鼠脑组织中SphK1和S1P1的表达,APP/PS1+生理盐水组小鼠脑组织中SphK1和S1P1水平较WT组显著下降,APP/PS1+外泌体组小鼠脑组织中SphK1和S1P1水平较APP/PS1+生理盐水组明显提高。水迷宫实验中APP/PS1+外泌体+SKⅠ-Ⅱ组小鼠空间学习和记忆能力较APP/PS1+外泌体组小鼠下降;APP/PS1+外泌体+VPC23019组小鼠空间学习和记忆能力较APP/PS1+外泌体组小鼠下降。硫黄素S染色中,APP/PS1+盐水组小鼠大脑皮层和海马中Aβ水平较WT组增加;外泌体处理组小鼠大脑皮层和海马中Aβ水平较盐水组明显下降;与APP/PS1+外泌体组相比,APP/PS1+外泌体+SKⅠ-Ⅱ组和APP/PS1+外泌体+VPC23019组小鼠大脑皮层和海马中Aβ水平均显著升高,SKⅠ-Ⅱ或VPC23019干预削弱了外泌体对AD模型小鼠淀粉样蛋白水平的抑制作用。免疫荧光数据显示,APP/PS1+盐水组小鼠大脑皮层和海马区NeuN的表达较WT组显著降低,APP/PS1+外泌体组小鼠脑皮层和海马NeuN的表达较盐水组明显增强,SKⅠ-Ⅱ和VPC23019干预组小鼠脑皮层和海马NeuN的表达均较外泌体处理组下降,即SKⅠ-Ⅱ或VPC23019干预削弱了外泌体对AD模型小鼠大脑神经元锥体细胞的上调作用。再次用ELISA检测小鼠脑组织中Aβ1-40和Aβ1-42的水平,APP/PS1+外泌体组小鼠脑组织中Aβ1-40和Aβ1-42水平较生理盐水组显著降低;SKⅠ-Ⅱ和VPC23019干预组小鼠脑组织中Aβ1-40和Aβ1-42水平较外泌体处理组升高,即SKⅠ-Ⅱ或VPC23019干预削弱了外泌体对AD模型小鼠脑组织中Aβ1-40和Aβ1-42水平的抑制作用。WB检测小鼠脑组织中BACE1、PS1和Nep的表达水平,APP/PS1+生理盐水组小鼠脑组织中BACE1PS1的水平较WT组明显升高,Nep的水平较WT组明显降低;APP/PS1+外泌体组小鼠脑组织中B ACE1和PS 1的水平较APP/PS1+生理盐水组显著降低,Nep的水平较APP/PS1+生理盐水组显著升高;SKⅠ-Ⅱ和VPC23019干预组小鼠脑组织中BACE1、PS1的水平较外泌体处理组升高,Nep的水平较外泌体处理组下降,即SKⅠ-Ⅱ或VPC23019干预削弱了外泌体对AD模型小鼠BACE1、PS1的下调及Nep的上调作用。结论:1.BM-MSCs来源的外泌体可改善AD模型小鼠的认知功能;2.BM-MSCs来源的外泌体通过激活SphK/S1P信号通路抑制AD模型小鼠的脑组织中Aβ沉积、促进Aβ降解;3.BM-MSCs来源的外泌体通过SphK/S1P信号通路提高AD模型小鼠大脑神经元锥体细胞的水平。