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TGF-β/Smads信号通路在早期胚胎发育、组织修复、细胞增殖与分化、凋亡和迁移、内分泌和免疫等多种生理过程中扮演着重要的角色。研究表明,TGF-βs与细胞外基质沉着有着密切的关系,并且是创伤愈合及瘢痕形成的主要因素之一。三角帆蚌是优良的淡水育珠蚌,由于插核育珠环节对蚌造成严重损伤并影响育珠质量,造成极大的经济损失,因此开展三角帆蚌TGF-β/smads信号通路的研究将有利于了解贝类的免疫及创伤修复机制,为其健康养殖提供理论基础。1.根据前期构建的三角帆蚌转录组文库中筛选出Smad3及Smad4基因片段设计特异性引物,利用RACE-PCR技术成功克隆出了HcSmad3及HcSmad4基因的cDNA序列全长。HcSmad3的5’端非编码区的大小为162bp,3’端非编码区的大小为633bp,开放阅读框为1257bp,共编码418个氨基酸,包含两个终止信号序列(AATAAA)以及一个PolyA尾巴,经预测其理论的等电点为6.09,分子量大小为47.28 kDa。HcSmad4的5’UTR大小为119bp,3’UTR大小为876bp,开放阅读框长度为1548bp编码515个氨基酸,预测其理论等电点与相对分子量大小分别是6.90和56.73 kDa。他们都拥有两个保守的结构域MH1(Smad3:29-129aa;Smad4:18-138aa)和MH2(Smad3:222-394aa;Smad4:287-513aa),并且均含有核定位信号NLS(Smad3:39-45aa;Smad4:31-49aa)和核输出信号NES(Smad3:359、362、365、367aa;Smad4:137-144aa)。2.经过实时荧光定量PCR分析,HcSmad3、HcSmad4和HcSmad5在三角帆蚌所有组织中均有表达,三者都是在闭壳肌中表达量最高,在肝胰脏、外套膜、鳃中表达量较低,在血细胞中表达量最低。3.用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和肽聚糖(PGN)刺激后,在血细胞中,与对照组比,HcSmad3在3h的表达量显著上调,然后恢复到原来的水平,在肝胰腺中,经嗜水气单胞菌刺激后,在6h、12h及24h表达量显著上调,然而肽聚糖刺激后无明显变化;经嗜水气单胞菌刺激后,在血细胞中,与对照组相比,HcSmad4在6h表达量最高,在肝胰腺中,HcSmad4在48h表达量最高。4.创伤后,HcSmad4的表达量较空白对照组显著增加,且其下游靶基因HcMMP1、HcMMP19、HcTIMP1和HcTIMP2表达量在一定程度上均上调;RNA干扰HcSmad3/4以及SIS3抑制HcSmad3后,下游基因的表达量较创伤组均下调。5.组织形态学结果表明,HcSmad3基因敲降或SIS3抑制剂处理可加速创伤愈合,而HcSmad4基因敲降可延缓蚌体伤口愈合过程。6.构建HcSmad3-PET32和HcSmad4-PET28重组质粒,HcSmad3蛋白只存在于包涵体中,而HcSmad4蛋白在上清和包涵体中均可表达。通过免疫日本实验级白兔获得HcSmad4的多克隆抗体。