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目的:本实验旨在探究KLD-12多肽/TGF-β1纳米纤维凝胶在体外实验中对兔纤维环细胞增殖、表型及功能的影响,寻找修复椎间盘退变的理想种子细胞、细胞支架及生长因子。方法:胰蛋白酶消化法提取6月龄新西兰大白兔腰椎纤维环内层细胞,体外培养至第3代,与KLD-12多肽纳米纤维凝胶及TGF-β1复合,制备KLD-12多肽/TGF-β1/纤维环细胞纳米纤维凝胶(实验组)和KLD-12多肽/纤维环细胞纳米纤维凝胶(对照组),体外培养14 d。倒置显微镜观察凝胶内细胞形态变化;细胞计数试剂盒(cell count kit 8,CCK-8)法检测细胞增殖活性;钙黄绿素(Calcein-AM)/碘化丙啶(PI)双荧光染色观察凝胶内活细胞与死亡细胞,并计算活细胞比率;阿尔新蓝法检测培养基中葡萄糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)含量;免疫荧光染色观察Ⅱ型胶原分泌情况;实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)检测纤维环细胞中Ⅱ型胶原及聚蛋白多糖(Aggrecan)基因表达情况。结果:(1)倒置显微镜观察复合于凝胶中的纤维环细胞呈圆形,少部分在凝胶边缘处贴壁生长的细胞呈多角型或长梭型。(2)CCK-8细胞增殖实验结果显示:实验组与对照组细胞增殖活性随培养时间延长呈非直线性增加趋势,实验组细胞增殖活性高于对照组(P<0.05)。(3)Calcein-AM/PI双荧光染色观察示:培养14d后,实验组和对照组凝胶内细胞活细胞比率分别97.44%±0.86%和94.04%±3.27%,比较差异无统计学意义(P>0.05)。(4)GAG检测示,实验组细胞分泌GAG含量随培养天数增加呈非直线上升,8 d达平台期;对照组GAG含量随时间上升至第8d达峰值,随后含量下降。第5、8d实验组GAG含量较对照组增多,差异有统计学意义(P<0.05),第11、14d时,实验组GAG含量较对照组分泌稳定,且具有显著性差异(P<0.01)。(5)免疫荧光染色示实验组与对照组细胞中II型胶原正常分泌,实验组中II型胶原含量显著高于对照组(P<0.01)。(6)RT-q PCR检测示,实验组及对照组凝胶内纤维环细胞均可见II型胶原和Aggrecan基因表达,实验组II型胶原及Aggrecan m RNA相对表达量均显著高于对照组(P<0.05)。结论:KLD-12多肽/TGF-β1纳米纤维凝胶具有生物活性,且可促进纤维环细胞增殖,维持细胞活性,提高GAG、II型胶原及Aggrecan等细胞外基质分泌。