蚕丝是一种复杂的微细纤维集合性天然蛋白,因具优良的特性被广泛使用和研究。然而力学性能上的一些缺陷,使得蚕丝的应用范围具有局限性。因此,蚕丝纤维的改性是拓展应用振兴产业的当务之急。蚕丝纤维的改性研究已有较长历史,改性的方法可分为物理改性、化学改性和遗传改性。物理和化学的改性方法只是对蚕丝进行修饰,不能从本质上改变蚕丝蛋白特性,且成本高、工序繁琐。利用遗传操作技术对蚕丝基因进行人工改造,能够获得性能更优良且可稳定遗传的新品系。蜘蛛丝是已知动物纤维中力学性能最优越的丝纤维,其蛋白特性、组分及成丝过程与蚕丝具有相似性,因此不断有学者尝试在家蚕丝腺中表达蜘蛛丝来提高蚕丝的力学性能,但外源基因表达量低一直是无法攻克的难题。如果能通过编辑蚕丝自身的基因来实现蚕丝性能的改良则是最经济有效的途径。研究发现蜘蛛丝重复区域序列较比蚕丝的更加规则有序,这可能是蜘蛛丝强于蚕丝的重要原因。丝素重链Fib-H基因是丝蛋白最重要的结构基因,具有长片段的重复区域,决定着蚕丝力学性能。有研究者发现对Fib-H进行截短后蚕丝的力学性能变差。那么,如果人为改造丝素重链使其序列更规则,长度更长就有可能获得保持天然特性的超强人工蚕丝。丝素重链高度重复和高GC含量的特性,使得利用常规的PCR技术和测序技术难以对其进行简单地克隆及编辑。因此,我们采用人工组装基因的方法对此设想做了初步的探索。本论文取得的主要成果如下:1、人工丝素重链(artFibH)的设计根据Fib-H基因的序列特征,我们选择重复序列最长的第七个重复区(R07)和第六个非重复区(A06)作为一个重复单元,称为“A06R07”。为保证人工丝素重链保持原来的序列特征,我们选择了两个IIs型限制内切酶:Bbs I和BsaI,在基因的两条链上各含有一个Bbs I和一个BsaI的识别序列,并且均设计在质粒载体上。Bbs I识别序列设计在A06R07序列的下游,其中一个设计在“A06R07”两个碱基之后,酶切后A06R07序列露出3?端TTGT末端;Bsa I识别序列设计在A06R07序列的两端,其中一个设计在A06R07序列的上游五个碱基之前,酶切后A06R07序列形成5?端AACA末端,另一个BbsI和Bsa I识别序列之间相距7个碱基,二者共用一个酶切位点,切出的一对粘性末端正好碱基互补,利用酶切连接的方法实现重复单元之间无缝连接加倍。2、artFibH转基因家蚕品系的建立经酶切验证,我们共成功构建了由Fib-H启动子驱动人工Fib-H基因的piggyBac转基因载体如下:pBac[R01A06R07R12]、pBac[R01(A06R07)3R12]、pBac[R01(A06R07)5R12]、pBac[R01(A06R07)5-last-R12]、pBac[R01(A06R07)3-Red-R12]、pBac[R01(A06R07)3-SELR13-R12]。以家蚕实用品系932为受体材料,利用显微注射技术,制备了转基因家蚕。通过荧光观察筛选到阳性个体。其中pBac[R01(A06R07)3R12]有2个蛾圈,阳性蛾圈率为0.2%,pBac[R01(A06R07)5R12]有1个蛾圈,阳性蛾圈率为0.5%。3、artFibH转基因蚕丝的相关检测通过蛋白预测软件分析3?型和5?型的人工Fib-H蛋白大小分别约为203KDa和295KDa,均小于家蚕932品系Fib-H蛋白(350KDa)。通过SDS-PAGE银染和Western Blot检测,结果显示预测目的条带并不明显,因此推测可能是由于其蛋白分子量太大而且具有自组装的特性,而滞留在点样孔中;通过冷冻切片技术获得单根茧丝的横截面直径,结果显示野生型与人工型茧丝形态和直径并无明显差异,表明artFibH的插入不会影响茧丝的正常形态和直径大小;通过应力应变拉伸试验,结果显示,与WT型相比,人工3?型和5?型茧丝伸长率稍有提高,强度、韧性、弹性模量稍有降低,表明由于转基因插入位点的不确定性,artFibH插入后降低了蚕丝的力学性能;通过傅立叶红外光谱试验,进一步分析了茧丝蛋白二级结构,结果显示,与WT型相比,人工3?型和5?型的茧丝蛋白构象中,β-折叠、α-螺旋和无规则卷曲含量稍有提高,β-转角含量稍有降低,表明成丝过程中artFibH会促进β-折叠的形成。