【摘 要】
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葡萄根癌病是葡萄上的重要病害之一,主要病原菌为葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis),严重影响葡萄的营养和经济价值。由于病原菌特殊的致病机制,物理防治和化学防治都不能从根本上抑制根癌病的发生,而生物防治是目前防治根癌病较为有效的方法。本研究对Ag-8菌株的生防机制进行初步探究,为找到生防作用相关的调控因子,采用转座子诱变技术对菌株进行诱变,筛选防效被严重削弱的突变体。利用Tail-
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葡萄根癌病是葡萄上的重要病害之一,主要病原菌为葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis),严重影响葡萄的营养和经济价值。由于病原菌特殊的致病机制,物理防治和化学防治都不能从根本上抑制根癌病的发生,而生物防治是目前防治根癌病较为有效的方法。本研究对Ag-8菌株的生防机制进行初步探究,为找到生防作用相关的调控因子,采用转座子诱变技术对菌株进行诱变,筛选防效被严重削弱的突变体。利用Tail-PCR的方法对得到的突变体进行转座子侧翼序列扩增,克隆目的基因序列获得基因功能。在此基础上,结合二代和三代测序技术,对菌株进行全基因组测序、分析和预测与生防相关的功能基因,从而在分子水平对生防菌的防治机制进行深入研究。综合上述研究,得到以下结果:(1)Ag-8菌株经16S rRNA和House-keeping gene鉴定为A.tumefaciens,具有不致瘤性,且对葡萄根癌病有较好的防治效果,在番茄上对根瘤的抑制率为73.63%,在葡萄上的抑制率为78.49%。Ag-8菌株平板上对致病菌A.vitis和A.tumefaciens都无拮抗作用,且不产生细菌素,但是能产生嗜铁素,推测其通过竞争营养间接杀死致病菌从而防治病害。另外Ag-8菌株可以很好的在番茄根部定殖,55天达到稳定期,定殖量为1.96×10~4cfu/g,进而验证其可使群体感应(Quorum sensing,QS)检测菌株NTL4变蓝,说明Ag-8菌株体内含有QS系统,使其优先占领受伤部位,阻止病原菌侵入植株体内,从而达到防治根癌病的目的。(2)通过双亲杂交的方法对Ag-8菌株进行突变,得到5200株含有转座子插入的突变体。将所有突变体在番茄上进行防效测定,初筛选出对根癌病防效严重削弱的突变体有38株。利用Tail-PCR扩增获得突变体转座子侧翼序列,通过克隆转化,最终测序得到目的片段。(3)利用二代和三代测序技术结合的方法对Ag-8菌株进行全基因组测序,分析发现Ag-8全基因组由两条染色体(Chromosome1和Chromosome2,Chr1和Chr2)和两条质粒(Plasmid A和Plasmid B,Pla A和Pla B)组成,全基因组总长5836420 bp,Chr1基因组长2859813 bp,Chr2基因组长2100538 bp,Pla A基因组长722025 bp,Pla B基因组长154044 bp,全基因组GC含量58.49%,编码基因6116个,基因占基因组长的87.56%。基因注释可知,Ag-8菌株共有19种功能不同的蛋白直系同源簇,与氨基酸转运、代谢、催化相关的基因数目较多,参与ABC transporters合成的基因最多是389个,其次是调控QS系统的基因有230个。体内外源遗传物质包含5个基因岛、2个前噬菌体,而阻挡外来基因的免疫系统有两种类型,铁摄取系统相关基因最多达126个。(4)全基因组水平分析得到,Ag-8体内与生防作用相关的系统有QS、Iron uptake system和traR/traM双因子调控系统,相关的基因有lhnR、F-avi4330、F-Avi5813、hspAT1、hspC、HspL。不致病的原因为Ag-8菌株质粒上没有完整的vir基因。
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