随着测序技术和生物信息学的飞速发展,越来越多的微生物基因组信息被揭示,通过对这些基因组信息的分析发现,目前已发现的天然产物仅仅只是微生物天然产物宝库的冰山一角,微生物基因组中还蕴藏着巨大的潜能等待挖掘。为了更加高效的挖掘微生物天然产物,特别是对于那些难以建立遗传操作系统或者是实验室无法培养的微生物而言,在基因组时代的今天,异源表达天然产物基因簇已成为一种有效的天然产物挖掘策略。因此,开发更加多样化、操作快速、简便的天然产物基因簇克隆技术显得尤为重要。本研究旨在建立一种基于CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein)基因编辑系统和体外包装系统相结合的一步法克隆技术,并应用该技术进行天然产物基因簇的靶向克隆,为微生物天然产物研究提供有效的技术支持。本策略利用Cas9蛋白将靶标片段从基因组DNA精确切割,然后经体外包装蛋白的包装侵染最终获得靶标基因簇。为了验证该靶向克隆策略,本研究以源于Streptomyces thiolactonus NRRL 15439的Tu?3010生物合成基因簇(27.4 kb)和源于Micromonospora inyoensis DSM 46123的西索米星(Sisomicin)生物合成基因簇(40.7 kb)为例,用来检测克隆片段大小接近噬菌体体外包装系统极限时的克隆效率。基于体外包装介导的一步法靶向克隆技术,我们分别从随机挑选的菌落中通过一轮PCR扩增,快捷、高效的克隆到了Tu?3010生物合成基因簇和西索米星生物合成基因簇,克隆效率分别为18%和54%。这两个案例表明,基于CRISPR/Cas9系统的体外包装克隆策略的有效克隆范围虽然与噬菌体体外包装容量(30-45 kb)一致,但是该克隆策略具有精准、耗时短且操作方便等特点,对于中等大小微生物天然产物基因簇的克隆具有重要的应用价值。我们将基于CRISPR/Cas9系统的体外包装克隆策略与本实验室前期开发的In vitro CRISPR/Cas9 editing(ICE)基因编辑技术偶联使用,在体外对Tu?3010基因簇中的调控基因stu R进行了同框缺失和启动子重构编辑。此外,运用该技术对M.inyoensis DSM 46123基因组中的另一个未知化合物生物合成基因簇thp进行了启动子重构编辑。异源表达结果表明,stu R对Tu?3010的合成具有正调控作用,但对其进行启动子重构却未对Tu?3010的合成造成明显影响;thp基因簇的启动子重构未能成功激活基因簇的表达。本研究还尝试将体外包装介导的靶向克隆策略与Gibson Assembly技术或是TAR(Transformation associated recombination)克隆技术偶联使用,克隆来自M.inyoensis DSM 46123的一个具有良好生物活性的化合物生物合成基因簇tln(64.3 kb),此部分工作目前仍在进行中。