目的肿瘤是威胁人类生命的重大疾病，目前尚无有效的特效药物。传统的治疗方案如手术、放化疗等手段普遍地存在治疗效果差，治疗的靶向性不好，肿瘤复发率高等缺陷。来自鸡贫血病毒CAV(chicken anemia virus)的凋亡素(Apoptin)是一种可以特异性诱导肿瘤细胞凋亡，而对人的正常细胞无毒副作用的蛋白。本实验致力于探索将Apoptin蛋白作为一种特异性抗肿瘤药物进行开发利用的方案。由于蛋白分子在体内的半衰期短，剂量可控，所以将具有靶向杀伤肿瘤细胞的活性蛋白分子作为肿瘤治疗的临床药物进行开发具有更高的安全性高和可控性。Apoptin虽然具有很好的特异诱导肿瘤细胞凋亡，对正常细胞安全无害的生物活性。但是其活性的作用靶点在细胞内部，蛋白分子必须进入细胞内部才能发挥生物活性。而Apoptin蛋白自身并不具备穿透细胞膜进入细胞内部的能力。因此我们决定将Apoptin基因与可以携带外源分子跨膜进入胞内的TAT基因相融合，构建TAT-Apoptin融合基因，其表达产物为具有自穿膜能力的Apoptin蛋白分子。原核表达系统具有遗传背景清晰、周期短、成本低、可以高水平地表达外源蛋白等明显优势。但是利用原核表达系统表达外源蛋白时，容易形成无活性的包涵体使原核表达系统的优势大打折扣。本实验根据包涵体形成的原因，通过优化诱导表达的条件，摸索可以适当地抑制大肠杆菌的表达活力来防止表达系统过载，抑制包涵体的形成，又可以获得大量可溶性的天然状态融合蛋白的原核表达条件。方法利用生物工程技术，从鸡贫血病毒DNA中分离提取Apoptin基因，构建Apoptin原核表达质粒。转化大肠杆菌中表达Apoptin蛋白，检测Apoptin基因在原核表达系统中的表达情况。人工合成TAT序列，将TAT序列与报告基因融合构建原核表达系统。纯化表达的融合蛋白，将蛋白与肿瘤细胞共孵育，通过检测报告基因EGFP检测我们合成的TAT序列的穿膜活性。通过生物工程手段将TAT基因与Apoptin基因融合构建融合基因的原核表达载体，利用原核表达系统表达融合蛋白。并优化制备具有高效生物活性的Apoptin融合蛋白的最佳条件。结果本实验成功从CAV的DNA中获得Apoptin基因。并构建了Apoptin基因的原核表达系统， Apoptin基因在E. coli BL21（DE3）中成功表达。通过人工合成的方法成功获得了TAT序列，并通过将其与报告基因EGFP相连，构建了TAT-EGFP融合基因的原核表达载体。TAT-EGFP与Hela细胞共孵育1h后，细胞内可以检测到明显的绿色荧光，证明了我们合成的TAT序列具有较高的穿膜活性。成功地构建了pET-30a-TAT-Apoptin和pGEX-6p-1-TAT-Apoptin原核表达载体，并在E. coli BL21（DE3）中成功表达。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在。通过对原核表达系统可溶性表达融合蛋白条件的摸索，最终确定pET-30a-TAT-Apoptin质粒在E. coli BL21（DE3）中诱导表达时，诱导表达条件为20℃，0.5mmol/LIPTG过夜诱导，pGEX-6p-1-TAT-Apoptin质粒在E. coli BL21（DE3）中诱导表达时，诱导表达条件为20℃，0.1mmol/LIPTG过夜诱导，可以最大限度地使融合蛋白以天然可溶状态的形式被表达。经优化后，可溶性天然蛋白占表达总蛋白的比例由23%上升至82%。通过对亲和纯化天然可溶蛋白失败的分析，推断失败的原因可能为天然蛋白表面电荷的影响，并由此改变亲和纯化实验方案，改进后的方案成功地利用亲和层析纯化到了原核表达系统表达的天然状态的融合蛋白。并通过MTT实验验证了我们利用原核表达系统表达的天然状态的融合蛋白具有高效生物活性，加入TAT-Apoptin的肿瘤细胞24小时后细胞存活率仅为10.86%，而加入缓冲液的对照组细胞生长并未受到明显影响，实验结果具有差异显著性(P<0.001)。