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研究目的：
铅黄肠球菌，属于革兰阳性肠球菌属，是人类以及动物胃肠道中的正常菌群，是一种条件致病菌。本文通过全基因组测序以及比较基因组学分析探讨临床分离菌株铅黄肠球菌EC369的耐药机制以及与耐药基因相关的可移动遗传元件。本文研究结果可以帮助我们能够更好的了解肠球菌的分子生物学特征，为以后进一步研究铅黄肠球菌的耐药性机制提供实验依据，同时也为临床治疗提供参考。
研究方法：
1.在浙江省丽水市人民医院，从一名肝内外胆管结石的女性患者的胆汁标本中，分离纯化菌株，菌株经过梅里埃全自动微生物鉴定系统进行初步鉴定。
2.根据CLSI推荐的琼脂稀释法对分离纯化的菌株进行药物敏感性（最小抑菌浓度，MIC值）测定，分析临床分离菌株的耐药情况。
3.通过碱裂解法，提取菌株铅黄肠球菌EC369的基因组DNA，利用新一代测序技术进行全基因组测序，序列利用生物信息学软件对测序读长进行序列拼接和校正，从而获得完整的基因组序列，然后预测全基因组的开放阅读框（ORFs）并对其进行功能注释。分析耐药基因与可移动遗传元件的关系，并探讨耐药基因的水平转移机制。
4.利用在线工具预测16SrRNA，并在NCBI数据库里进行序列比对分析（BlastN、BlastP），进一步判断菌株EC369所属种属。
5.利用NCBI的Blast工具，对铅黄肠球菌EC369质粒pEC369的基因组序列进行比较基因组学分析，再利用CGview等工具制作质粒pEC369物理图谱以及比较基因组学分析结果的可视化图谱。对质粒pEC369上的耐药基因及它们两侧翼序列在NCBI数据库中进行序列比对，进行可视化作图。
6.以铅黄肠球菌EC369基因组为模版，进行耐药性基因（aph3’、ant6、bla、sat4、ermB）的PCR产物克隆，克隆载体pUCP20、pUCP24选用大肠杆菌DH5α为受体菌，pAM401克隆载体的受体菌则为粪肠球菌JH2-2。利用琼脂稀释法，对克隆成功的菌株进行抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）测定，与原始菌株对比，观察克隆的ORFs是否具有耐药功能。
7.以粪肠球菌JH2-2为受体菌，铅黄肠球菌EC369为供体菌，用滤膜法进行接合转移实验。提取接合子质粒以及对接合子进行PCR用以验证可接合转移质粒。用琼脂稀释法对原始菌、受体菌以及接合子进行药物敏感性实验。
研究结果：
1.经过梅里埃全自动微生物鉴定系统进行的初步鉴定，16SrRNA基因同源性比对显示与该菌株同源性较高的菌株是一株铅黄肠球菌LMG10745和两株鹑鸡肠球菌(LMG13129,NBRC100675)。基因组比对结果显示与EC369基因组序列同源性最高的两株细菌为铅黄肠球菌EC20以及肠球菌FDAARGOS_375。确认该菌株为铅黄肠球菌。
2.铅黄肠球菌EC369具有1个染色体（大小为3.58M），编码3333个ORFs，1个质粒（大小为91960bp），编码95个ORFs。
3.药物敏感性检测结果显示铅黄肠球菌EC369对链霉素、卡那霉素、红霉素3种抗生素高浓度耐药，MIC值均>1024μg/ml，对其他种类的抗生素敏感。
4.质粒pEC369在NCBI数据库中，覆盖度最高的三个质粒是粪肠球菌的质粒pRE25、肠球菌FDAARGOS_375的质粒、以及屎肠球菌F12085质粒。在以上三个质粒中，肠球菌属FDAARGOS_375的质粒最大，该质粒比质粒pEC369大，且序列中不包括存在于质粒pEC369中的耐药基因。
5.成功克隆aph3’、ant6、bla、sat4、ermB5个耐药基因，与对照菌株相比，aph3’、ant6、ermB具有功能，而基因sat4、ermB则不具有耐药功能。
6.对EC369进行的接合转移实验，成功获得一株接合子。药敏结果实验表明质粒pEC369在原始菌株以及接合子的耐药性中起到重要的作用。
研究结论：
临床分离菌株EC369属于肠球菌属中铅黄肠球菌这一菌种，该菌株的基因组大小与NCBI数据库中已拼接完成的铅黄肠球基因组大小较为接近。发现该菌株对链霉素、卡那霉素、红霉素3种抗生素高浓度耐药，而对氨苄西林、万古霉素、替考拉宁等药物敏感。菌株所含有质粒pEC369可以进行接合转移，质粒上存在一个转座子结构与质粒的耐药性相关，且耐药区域与金黄色葡萄球菌GD1677基因组上的一段序列极为相似。因此可以推测这个耐药性基因相关的可移动遗传元件可以通过水平基因转移在不同种属的细菌中传播。
铅黄肠球菌，属于革兰阳性肠球菌属，是人类以及动物胃肠道中的正常菌群，是一种条件致病菌。本文通过全基因组测序以及比较基因组学分析探讨临床分离菌株铅黄肠球菌EC369的耐药机制以及与耐药基因相关的可移动遗传元件。本文研究结果可以帮助我们能够更好的了解肠球菌的分子生物学特征，为以后进一步研究铅黄肠球菌的耐药性机制提供实验依据，同时也为临床治疗提供参考。
研究方法：
1.在浙江省丽水市人民医院，从一名肝内外胆管结石的女性患者的胆汁标本中，分离纯化菌株，菌株经过梅里埃全自动微生物鉴定系统进行初步鉴定。
2.根据CLSI推荐的琼脂稀释法对分离纯化的菌株进行药物敏感性（最小抑菌浓度，MIC值）测定，分析临床分离菌株的耐药情况。
3.通过碱裂解法，提取菌株铅黄肠球菌EC369的基因组DNA，利用新一代测序技术进行全基因组测序，序列利用生物信息学软件对测序读长进行序列拼接和校正，从而获得完整的基因组序列，然后预测全基因组的开放阅读框（ORFs）并对其进行功能注释。分析耐药基因与可移动遗传元件的关系，并探讨耐药基因的水平转移机制。
4.利用在线工具预测16SrRNA，并在NCBI数据库里进行序列比对分析（BlastN、BlastP），进一步判断菌株EC369所属种属。
5.利用NCBI的Blast工具，对铅黄肠球菌EC369质粒pEC369的基因组序列进行比较基因组学分析，再利用CGview等工具制作质粒pEC369物理图谱以及比较基因组学分析结果的可视化图谱。对质粒pEC369上的耐药基因及它们两侧翼序列在NCBI数据库中进行序列比对，进行可视化作图。
6.以铅黄肠球菌EC369基因组为模版，进行耐药性基因（aph3’、ant6、bla、sat4、ermB）的PCR产物克隆，克隆载体pUCP20、pUCP24选用大肠杆菌DH5α为受体菌，pAM401克隆载体的受体菌则为粪肠球菌JH2-2。利用琼脂稀释法，对克隆成功的菌株进行抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）测定，与原始菌株对比，观察克隆的ORFs是否具有耐药功能。
7.以粪肠球菌JH2-2为受体菌，铅黄肠球菌EC369为供体菌，用滤膜法进行接合转移实验。提取接合子质粒以及对接合子进行PCR用以验证可接合转移质粒。用琼脂稀释法对原始菌、受体菌以及接合子进行药物敏感性实验。
研究结果：
1.经过梅里埃全自动微生物鉴定系统进行的初步鉴定，16SrRNA基因同源性比对显示与该菌株同源性较高的菌株是一株铅黄肠球菌LMG10745和两株鹑鸡肠球菌(LMG13129,NBRC100675)。基因组比对结果显示与EC369基因组序列同源性最高的两株细菌为铅黄肠球菌EC20以及肠球菌FDAARGOS_375。确认该菌株为铅黄肠球菌。
2.铅黄肠球菌EC369具有1个染色体（大小为3.58M），编码3333个ORFs，1个质粒（大小为91960bp），编码95个ORFs。
3.药物敏感性检测结果显示铅黄肠球菌EC369对链霉素、卡那霉素、红霉素3种抗生素高浓度耐药，MIC值均>1024μg/ml，对其他种类的抗生素敏感。
4.质粒pEC369在NCBI数据库中，覆盖度最高的三个质粒是粪肠球菌的质粒pRE25、肠球菌FDAARGOS_375的质粒、以及屎肠球菌F12085质粒。在以上三个质粒中，肠球菌属FDAARGOS_375的质粒最大，该质粒比质粒pEC369大，且序列中不包括存在于质粒pEC369中的耐药基因。
5.成功克隆aph3’、ant6、bla、sat4、ermB5个耐药基因，与对照菌株相比，aph3’、ant6、ermB具有功能，而基因sat4、ermB则不具有耐药功能。
6.对EC369进行的接合转移实验，成功获得一株接合子。药敏结果实验表明质粒pEC369在原始菌株以及接合子的耐药性中起到重要的作用。
研究结论：
临床分离菌株EC369属于肠球菌属中铅黄肠球菌这一菌种，该菌株的基因组大小与NCBI数据库中已拼接完成的铅黄肠球基因组大小较为接近。发现该菌株对链霉素、卡那霉素、红霉素3种抗生素高浓度耐药，而对氨苄西林、万古霉素、替考拉宁等药物敏感。菌株所含有质粒pEC369可以进行接合转移，质粒上存在一个转座子结构与质粒的耐药性相关，且耐药区域与金黄色葡萄球菌GD1677基因组上的一段序列极为相似。因此可以推测这个耐药性基因相关的可移动遗传元件可以通过水平基因转移在不同种属的细菌中传播。