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目的
鼻疽诺卡菌是一种机会致病菌，其感染人体后会侵袭人体的肺、脑、皮肤等器官，导致相应的疾病，但其致病机制特别是诺卡菌的毒力及其抵抗人体免疫细胞杀伤的能力还不清楚，本论文在构建鼻疽诺卡菌mce4A基因缺失株后，从细胞及动物等不同层面研究该基因在鼻疽诺卡菌中是否具有粘附侵袭力、毒力及抗杀伤的能力，了解mce4A基因的功能，以期发现新的免疫靶位，为疫苗制作及新药研发提供理论基础。
方法
1.构建打靶载体：
扩增目的基因上下游片段并通过重叠延伸PCR的方法将两段扩增产物制成融合片段，并将其与自杀质粒连接为打靶载体。
2.构建mce4A基因缺失株：
将打靶载体以电转化的方式转导进入鼻疽诺卡菌胞内，通过新霉素抗性培养基进行一次筛选以及10%蔗糖培养基进行二次筛选获得mce4A基因的缺失株，并通过检测mce4A基因下游5个基因的表达量来确证采用无标记的框内敲除法进行基因敲除无下游的极化效应。
3.生长曲线测定：
将两种细菌在营养丰富的培养基中进行培养，分别于0h、6h、12h、16h、20h、24h、30h、42h、54h、66h、78h检测两种细菌的吸光度值，绘制生长曲线，其中时间作为横坐标，吸光度作为纵坐标。
4.检测野生株与缺失株粘附侵袭力差异：
野生株细菌与缺失株细菌分别与Hela细胞以MOI1∶100的比例共同孵育1h，PBS洗掉游离细菌，裂解细胞后倍比稀释，进行菌落计数，用公式：粘附侵袭率=粘附侵袭数量/接种前细菌数量×100%计算两种细菌的粘附侵袭率，以及用吉姆萨染色的方法直接观察粘附情况，比较mce4A基因缺失后鼻疽诺卡菌粘附侵袭力是否减弱。
5.动物体内检测两种细菌毒力差异：
用两种方法将细菌接种到小鼠体内，通过检测小鼠平均体重变化、发病情况及生存率等指标判断野生株与缺失株的毒力差异。
6.全血杀伤实验：
采集新鲜兔心脏全血，与两种细菌分别孵育于37℃恒温水浴箱中，在1h、3h、6h、12h将混合体系倍比稀释后涂板，进行菌落计数，观察两种细菌在全血中抗杀伤能力是否有差异。
7.细菌在细胞内存活情况研究：
将两种细菌分别与THP-1分化成的巨噬细胞以MOI1∶1的比例混合共同作用，待细菌侵入细胞内后培养0h、3h、6h、12h，以0h细菌数量为100%计算存活率。
结果
1.成功构建mce4A缺失株：
经过两次同源重组，打靶载体中的上下游融合片段成功置换mce4A基因，经正反两次PCR验证，结果表明已经成功将目的基因从鼻疽诺卡菌中敲除。RT-PCR检测mce4A下游基因表达量，表明框内缺失法无极化效应，无需制作回补株。
2.体外生长曲线：
在营养丰富且氧气充足的情况下，野生株与突变株的生长速率以及生长特点几乎相同，差异无统计学意义（p＞0.05）。
3.粘附侵袭力检测：
mce4A基因敲除后，对野生株与缺失株的粘附侵袭率进行比较，结果显示，在两种细菌与Hela细胞共同孵育1h后，野生株的粘附侵袭率为22.4%，缺失株的粘附侵袭率为6.1%，，差异有统计学意义（p＜0.05），吉姆萨染色镜下观察野生株的粘附率也约为缺失株的二倍。
4.毒力检测：
在动物体内检测野生株与突变株的毒力，结果显示腹腔注射组接种缺失株的小鼠至观察截止全部存活，接种野生株的小鼠死亡率为50%；接种缺失株的小鼠体重变化较小、毛发顺滑，接种野生株的小鼠体重变化大，毛发稀疏；静脉注射组接种缺失株的小鼠死亡时间较野生组延后。
5.全血杀伤实验：
鼻疽诺卡菌在体外与兔心脏全血混合后孵育不同时间，发现鼻疽诺卡菌活菌数量减少。将野生株与突变株分别与心脏全血混合孵育，在1h、3h、6h、12h时间点取样倍比稀释后进行菌落计数，结果野生株3h存活率为74.43%，6h存活率为41.76%，12h存活率为31.88%，缺失株3h存活率为68.56%，6h存活率为27.83%，12h存活率为6.51%，差异有统计学意义（p＜0.05）。
6.巨噬细胞内存活研究：
以MOI1∶1的比例将野生株与突变株分别接种于巨噬细胞中，在0h、3h、6h、24h时间点检测细菌数量，结果显示野生株存活数量3h、6h、24h分别为74.57%，40.36%，18.19%；缺失株存活数量3h、6h、24h分别为40.09%，22.56%，11.19%.差异有统计学意义（p＜0.05,p＜0.01）
结论
1.成功构建mce4A基因缺失株，且采用框内敲除的方法无下游极化效应，无需制作回补株。
2.mce4A基因缺失后，鼻疽诺卡菌在细胞水平上的粘附侵袭力减弱，在动物水平上显示毒力减弱，说明mce4A基因在鼻疽诺卡菌中起到了粘附侵袭等增加细菌毒力的作用。
3.在体外，mce4A基因缺失后，鼻疽诺卡菌的抗全血杀伤能力及抗巨噬细胞杀伤能力减弱，说明mce4A基因在鼻疽诺卡菌抵抗外界生存压力的过程中起到了一定的作用。
鼻疽诺卡菌是一种机会致病菌，其感染人体后会侵袭人体的肺、脑、皮肤等器官，导致相应的疾病，但其致病机制特别是诺卡菌的毒力及其抵抗人体免疫细胞杀伤的能力还不清楚，本论文在构建鼻疽诺卡菌mce4A基因缺失株后，从细胞及动物等不同层面研究该基因在鼻疽诺卡菌中是否具有粘附侵袭力、毒力及抗杀伤的能力，了解mce4A基因的功能，以期发现新的免疫靶位，为疫苗制作及新药研发提供理论基础。
方法
1.构建打靶载体：
扩增目的基因上下游片段并通过重叠延伸PCR的方法将两段扩增产物制成融合片段，并将其与自杀质粒连接为打靶载体。
2.构建mce4A基因缺失株：
将打靶载体以电转化的方式转导进入鼻疽诺卡菌胞内，通过新霉素抗性培养基进行一次筛选以及10%蔗糖培养基进行二次筛选获得mce4A基因的缺失株，并通过检测mce4A基因下游5个基因的表达量来确证采用无标记的框内敲除法进行基因敲除无下游的极化效应。
3.生长曲线测定：
将两种细菌在营养丰富的培养基中进行培养，分别于0h、6h、12h、16h、20h、24h、30h、42h、54h、66h、78h检测两种细菌的吸光度值，绘制生长曲线，其中时间作为横坐标，吸光度作为纵坐标。
4.检测野生株与缺失株粘附侵袭力差异：
野生株细菌与缺失株细菌分别与Hela细胞以MOI1∶100的比例共同孵育1h，PBS洗掉游离细菌，裂解细胞后倍比稀释，进行菌落计数，用公式：粘附侵袭率=粘附侵袭数量/接种前细菌数量×100%计算两种细菌的粘附侵袭率，以及用吉姆萨染色的方法直接观察粘附情况，比较mce4A基因缺失后鼻疽诺卡菌粘附侵袭力是否减弱。
5.动物体内检测两种细菌毒力差异：
用两种方法将细菌接种到小鼠体内，通过检测小鼠平均体重变化、发病情况及生存率等指标判断野生株与缺失株的毒力差异。
6.全血杀伤实验：
采集新鲜兔心脏全血，与两种细菌分别孵育于37℃恒温水浴箱中，在1h、3h、6h、12h将混合体系倍比稀释后涂板，进行菌落计数，观察两种细菌在全血中抗杀伤能力是否有差异。
7.细菌在细胞内存活情况研究：
将两种细菌分别与THP-1分化成的巨噬细胞以MOI1∶1的比例混合共同作用，待细菌侵入细胞内后培养0h、3h、6h、12h，以0h细菌数量为100%计算存活率。
结果
1.成功构建mce4A缺失株：
经过两次同源重组，打靶载体中的上下游融合片段成功置换mce4A基因，经正反两次PCR验证，结果表明已经成功将目的基因从鼻疽诺卡菌中敲除。RT-PCR检测mce4A下游基因表达量，表明框内缺失法无极化效应，无需制作回补株。
2.体外生长曲线：
在营养丰富且氧气充足的情况下，野生株与突变株的生长速率以及生长特点几乎相同，差异无统计学意义（p＞0.05）。
3.粘附侵袭力检测：
mce4A基因敲除后，对野生株与缺失株的粘附侵袭率进行比较，结果显示，在两种细菌与Hela细胞共同孵育1h后，野生株的粘附侵袭率为22.4%，缺失株的粘附侵袭率为6.1%，，差异有统计学意义（p＜0.05），吉姆萨染色镜下观察野生株的粘附率也约为缺失株的二倍。
4.毒力检测：
在动物体内检测野生株与突变株的毒力，结果显示腹腔注射组接种缺失株的小鼠至观察截止全部存活，接种野生株的小鼠死亡率为50%；接种缺失株的小鼠体重变化较小、毛发顺滑，接种野生株的小鼠体重变化大，毛发稀疏；静脉注射组接种缺失株的小鼠死亡时间较野生组延后。
5.全血杀伤实验：
鼻疽诺卡菌在体外与兔心脏全血混合后孵育不同时间，发现鼻疽诺卡菌活菌数量减少。将野生株与突变株分别与心脏全血混合孵育，在1h、3h、6h、12h时间点取样倍比稀释后进行菌落计数，结果野生株3h存活率为74.43%，6h存活率为41.76%，12h存活率为31.88%，缺失株3h存活率为68.56%，6h存活率为27.83%，12h存活率为6.51%，差异有统计学意义（p＜0.05）。
6.巨噬细胞内存活研究：
以MOI1∶1的比例将野生株与突变株分别接种于巨噬细胞中，在0h、3h、6h、24h时间点检测细菌数量，结果显示野生株存活数量3h、6h、24h分别为74.57%，40.36%，18.19%；缺失株存活数量3h、6h、24h分别为40.09%，22.56%，11.19%.差异有统计学意义（p＜0.05,p＜0.01）
结论
1.成功构建mce4A基因缺失株，且采用框内敲除的方法无下游极化效应，无需制作回补株。
2.mce4A基因缺失后，鼻疽诺卡菌在细胞水平上的粘附侵袭力减弱，在动物水平上显示毒力减弱，说明mce4A基因在鼻疽诺卡菌中起到了粘附侵袭等增加细菌毒力的作用。
3.在体外，mce4A基因缺失后，鼻疽诺卡菌的抗全血杀伤能力及抗巨噬细胞杀伤能力减弱，说明mce4A基因在鼻疽诺卡菌抵抗外界生存压力的过程中起到了一定的作用。