2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）是大宗发酵产品维生素C的直接前体。当前,2-KLG的工业生产主要采用经典的三菌二步发酵法。该方法是对莱氏法的巨大改进,极大地简化了2-KLG的生产流程,有效的降低了2-KLG的生产成本。但随着合成生物学及代谢工程的迅猛发展,研究者们越来越追求一菌一步的2-KLG生产工艺。一菌一步法取代三菌二步法意味着2-KLG的生产将具有更为稳定的工艺以及更为低廉的生产成本。几十年来,世界范围内的维生素C工业生产领域都在尝试应用更经济的一菌一步发酵路线取代三菌二步发酵过程,我国的维生素C产业改革升级迫在眉睫。在实验室规模上一菌一步生产维生素C已经取得了很大进展,但到目前为止仍无法取代传统的三菌二步发酵法进行工业化生产。考虑到氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）作为底盘细胞的巨大优势和潜力,本研究选取氧化葡萄糖酸杆菌作为改造宿主,通过开发基于蔗糖果聚糖酶（Sac B）的基因编辑系统及基于氧化葡萄糖酸杆菌内源IE型CRISPR-Cas的基因调控系统,构建了用于氧化葡萄糖酸杆菌的大规模基因组改造及调控工具;通过组学分析及理性代谢工程,构建了氧化葡萄糖酸杆菌一步菌底盘细胞库;通过酶工程、辅因子工程、电子传递链工程及中心碳代谢调控,构建了高产2-KLG的一步菌;最后,通过两阶段发酵优化进一步提高了2-KLG产量。研究工作为最终构建可以工业化应用的维生素C一步发酵菌株提供了有效的遗传工具、丰富的底盘细胞库和代谢工程改造模块,对维生素C产业革新具有重要参考意义。具体工作内容包括:（1）开发了基于Sac B的基因编辑系统。针对氧化葡萄糖酸杆菌中缺乏有效的基因编辑工具的问题,通过筛选得到大肠杆菌（Escherichia coli）和氧化葡萄糖酸杆菌中均具有功能的穿梭启动子,并使用Sac B作为反选标签,开发了基于Sac B的基因编辑系统。利用该系统成功在氧化葡萄糖酸杆菌中实现了基因敲除、基因插入和基因替换等多种基因编辑,效率达到50%。并且该系统也展现出了多基因编辑的潜力。此系统的开发为氧化葡萄糖酸杆菌的大规模基因组工程提供了有效的基础工具。（2）开发了基于内源IE型CRISPR-Cas的基因调控系统。针对氧化葡萄糖酸杆菌缺乏有效的基因调控工具的问题,通过对氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003基因组进行分析,鉴定并表征了其内源性IE型CRISPR-Cas系统。进而确定了其PAM（protospacer adjacent motif）序列并表达相应cr RNA（CRISPR RNA）使该系统成为了有效的CRISPRi（CRISPR interference）系统,其对单基因表达抑制程度达到90%。同时验证了该系统对基因表达抑制程度的靶点依赖性及多基因表达的抑制能力。最后,利用该CRISPRi系统对菌株碳通量进行了调控,提高了菌株的生长速率及产物生产速率。（3）构建了氧化葡萄糖酸杆菌一步菌底盘细胞库。针对传统的从突变库或自然界筛选2-KLG一步菌工作量大的问题,通过对基因组含有山梨糖脱氢酶（SDH）和山梨酮脱氢酶（SNDH）基因的不同氧化葡萄糖酸杆菌进行蛋白组分析,结合对SDH和SNDH催化糖酸转化的功能验证,鉴定了SDH和SNDH表达量低是多数氧化葡萄糖酸杆菌中含有SDH和SNDH却不产2-KLG的关键因素。进而通过过量表达各氧化葡萄糖酸杆菌内源SDH和SNDH构建了相对丰富的2-KLG一步菌底盘细胞库。（4）系统代谢工程改造氧化葡萄糖酸杆菌提高了2-KLG产量。针对氧化葡萄糖酸杆菌一步菌2-KLG产量低的问题,通过对限速酶SDH的N端编码序列进行同义突变以及强化伴侣蛋白表达进一步提高了限速酶SDH的表达量,然后结合辅因子工程、电子传递链工程、中心碳代谢调控及两阶段发酵,将氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC 1.110中的2-KLG产量从检测限以下提高到了5 L发酵罐中的61.8 g/L。