油莎草内生菌的促生效应及黄酮类化合物的合成机制研究

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油莎草(Cyperus esculentus L.Var.Sativus,C.esculentus L.)是莎草科,莎草属,多年生草本植物。油莎草地上茎叶中含有黄酮类化合物,具有多种药用活性如抗氧化、改善脑缺血损伤等,有望作为干预缺血性脑中风的候选新药资源。然而次生代谢产物因其产量低、含量不均一等现象成为制约植物药材产业化应用的核心问题。近年来,植物内生菌对活性物质积累的促进作用得到大量研究的证实,寻找次生代谢合成途径、关键酶基因及其机理已成为研究热点。关于内生菌与油莎草互作促进其黄酮类化合物积累及其调控机制方面的研究具有重要的理论意义和应用价值,国内外研究尚未见报道。本研究利用高通量测序技术对油莎草不同品种、区室进行微生物多样性研究,探索相关微生物操作分类单元(OTUs)分布、群落组成、结构及其功能。在此基础上,以油莎草地上茎叶为实验材料,分离鉴定出两株内生菌,通过常压室温等离子体诱变技术(ARTP)筛选出正向突变菌株,并对突变株进行促生功能研究及全基因组测序分析,探索其潜在机制。此外,结合转录组学挖掘油莎草黄酮类化合物的关键基因,利用代谢组学分析方法探讨内生菌处理下油莎草地上茎叶中黄酮代谢物的变化。主要研究结果如下:(1)高通量测序技术研究不同品种油莎草根、地上茎叶、种子及根际土壤的微生物多样性。结果表明,除了圆粒品种地上茎叶和长粒品种地上茎叶样本外,品种对细菌和真菌的α-多样性指数的影响不显著,根际土壤中的细菌和真菌α-多样性与其他植物区室相比存在显著差异。主坐标分析(PCo A)和群落相似性分析(ANOSIM)分析揭示了不同植物区室间的群落结构具有显著性差异,而品种之间无显著差异。最后确定了与油莎草植物区室相关的细菌和真菌群落的功能特征,为进一步研究微生物群落与植物之间的作用机制提供了基础。(2)油莎草内生菌的分离鉴定及促生特性研究。以油莎草地上茎叶为实验材料,分离鉴定出两株内生菌,YSD J2和YSD YN2。分析发现,两株菌均表现出良好的促生特性,如耐盐、解磷、解钾、产吲哚乙酸(IAA)及产铁载体。通过16S r RNA和生理生化测试,确认YSD J2属于泛菌属(Pantoea sp.),YSD YN2属于克罗诺杆菌属(Cronobacter sp.)。YSD J2和YSD YN2通过ARTP技术诱变,得到诱变时间为125 s下IAA和有机磷浓度均提高的正向突变株。突变株YSD J2和YSD YN2均能提高植物生物量,表现出明显的促根及促生效果,同时,两株突变株均能提高植物的抗氧化活性。(3)结合二代和三代测序方法对突变株YSD J2和YSD YN2进行全基因组测序。结果显示,YSD J2含有1个染色体,1个质粒,全基因大小为5001301 bp,G+C含量为57.48%,编码基因的数量为4668,编码蛋白的基因为4567个。YSD YN2含有1个染色体,1个质粒,全基因大小为4108301 bp,G+C含量为57.38%,编码基因的数量为3979个,编码蛋白的基因为3877个。功能分类注释的结果显示,这两株突变株均具有较完善的生长、代谢相关能力。通过基因组挖掘,在突变株YSD J2和YSD YN2基因组中均发现了不同的PGP相关基因/基因簇,揭示了其促生机理。(4)采用高通量测序技术比较分析了不同生长时期油莎草地上茎叶转录组的变化及其差异。结果显示,共有14497条基因序列获得了注释,共涉及代谢、遗传信息处理、环境信息处理等5个通路大类。KEGG富集分析显示,三个比较组(127 d vs 102 d,148d vs 102 d,148 d vs 127 d)中注释到次级代谢产物代谢的差异表达基因数目较多的是苯丙烷和类黄酮生物合成。通过对苯丙烷及黄酮类化合物合成途径的表达谱进行综合分析,获得了黄酮合成相关候选基因,并绘制出油莎草地上茎叶中黄酮类化合物的合成线路图。(5)基于超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术对两株内生菌处理下的油莎草样本进行代谢组学分析。最终鉴定了油莎草地上茎叶中的301个化合物。按照黄酮类化合物的二级分类,可分为12个大类,注释到化合物最高的类别为黄酮94个(31.23%)。共3个差异代谢物(DEMs)在三个比较组间(YSD J2 vs CK、YSD YN2vs CK、YSD YN2 vs YSD J2)均差异表达。KEGG注释结果显示,YSD J2和YSD YN2处理均能使异甘草素、紫铆花素等7个化合物显著富集,其机制推测是这两株内生菌产生的IAA显著激活了在细胞壁维管束细胞韧皮部中大量分布的查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)及查尔酮还原酶(CHR)转录水平的表达,使得黄酮类物质大量积累。同时,两株内生菌处理均能使牡荆素、异牡荆素含量显著降低,牡荆素、异牡荆素含量的降低能够导致芹菜素含量的积累,使反应进入黄酮和黄酮醇的代谢中,或者形成二氢黄酮醇,进一步积累黄酮类化合物。
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