论文部分内容阅读
家蚕（Bombyx mori）是一种重要的经济昆虫,属于鳞翅目完全变态昆虫,常作为鳞翅目昆虫的模式生物用于相关基础研究。家蚕入眠蜕皮是其生长、发育、变态的重要生理过程之一,是在其长期进化中形成的遗传特性。本课题研究对象是一种2龄不眠蚕(non-molting in the 2nd instar,nm2)突变体,突变体大多数表现为2龄末期不入眠、不蜕皮、极少进食,维持此状态一周左右后相继死亡。前期研究已经确定BmCPG10是引起nm2突变的主效基因。本研究在前期的研究基础上,利用CRISPR/Cas9技术、数字基因表达谱（Digital Gene Expression,DGE）以及双向电泳技术对BmCPG10基因及相关基因的功能进行更为系统、详细的分析,以阐述该突变体发生的分子机制。主要研究结果如下:第一,利用CRISPR/Cas9编辑技术对BmCPG10基因的功能进行分析。在BmCPG10基因的1号外显子上选取合适的靶位点体外合成sgRNA,与Cas9蛋白混合注射到家蚕的早期胚胎中,经检测,有2头蚕在靶位点均出现4个碱基的缺失,其中一头蚕在2龄末期死亡,另一头为雄性蚕,正常发育并化蛾,该雄蛾与正常野生型雌蛾交配,所产卵多为不受精卵,暗示BmCPG10功能丧失不仅影响家蚕的生长发育,可能还会导致精子活性降低。BmCPG10基因在这两头发生编辑的蚕中均上调表达,与自然突变体nm2中BmCPG10的表达趋势一致。第二,利用DGE和qRT-PCR分析了nm2突变体和突变体原品种C603的2龄将眠蚕头部相关基因的表达情况。结果发现,在nm2突变体中,蜕皮激素信号通路上的相关基因差异显著,其中neverland、spook、sad显著上调表达,CYP314A1及CYP18A1显著下调表达;部分表皮蛋白基因差异显著,且上调表达的表皮蛋白基因多于下调表达的表皮蛋白基因;蜕皮激素介导的信号通路上的核受体基因也有表达上的差异,其中关键核受体基因βFTZ-F1显著上调表达,早晚期基因HR3和HR4显著下调表达,其他核受体基因均无显著变化。第三,以nm2突变体和C603野生型家蚕2龄将眠蚕包含第一对气管丛的前胸腺（PGW）为材料进行双向电泳（2-DE）分析。发现其中一个表皮蛋白基因BmCPR41在nm2突变体中显著上调,qRT-PCR在mRNA水平的检测结果与蛋白质水平一致,而且与表达谱研究结果一致。进一步分析发现BmCPR41基因在两头发生编辑的蚕中与BmCPG10基因同步上调表达。基于上述结果,我们推测BmCPR41基因虽然不是引起家蚕nm2突变体的主效基因,但它可能与BmCPG10基因协同作用,参与了nm2突变体的形成。通过上述分析,我们进一步明确了引起nm2突变性状的主效基因是BmCPG10基因,并证实了BmCPG10基因通过蜕皮激素信号通路调控家蚕生长发育的生理功能。同时又发现了一个蜕皮激素信号通路的下游基因,表皮蛋白基因BmCPR41可能与BmCPG10基因协同作用,引起nm2突变性状。本研究为进一步阐述nm2突变体的形成机制提供了证据,同时也有助于深入了解蜕皮激素在家蚕生长发育过程中的调控机制。