沙门氏菌(Salmonella)是一种常见的食源性致病菌,主要污染蔬菜、蛋和肉类等食品,由其引起的食品安全风险日益凸显。食品中沙门氏菌快速检测技术对于保障食品安全具有重要的意义。其中,在采用分子生物学方法检测食源性致病菌的过程中,由于食品中成分复杂,存在许多抑制剂影响检测方法的灵敏度。项目组前期研究表明,利用蒙脱石封闭活性炭(BCAC)前处理食品样品,能够有效吸附去除食品中的抑制剂,提高分子生物学方法的检测灵敏度。但目前对BCAC特征和作用机制尚不清楚。本研究着眼于BCAC的制备、表征、吸附机制,并应用BCAC前处理食品样品以提高实时荧光环介导等温扩增法(Rti-LAMP)的灵敏度。本研究首先优化BCAC的活性炭材质、蒙脱石与活性炭比例、吸附时间,接着用靛蓝胭脂红、色氨酸、硫胺素、单宁酸这四种纯物质作为水溶性抑制剂的代表物研究BCAC的吸附动力学,通过扫描电镜、红外光谱、拉曼光谱、零电荷点四种表征方法研究BCAC的特性。结果显示,在颗粒直径1.25-2 mm椰壳材质的活性炭,蒙脱石与活性炭比例1:4的条件下制备BCAC,吸附时间为15 min,细菌回收率高达94.0±8.9%,抑制剂吸附率高达73.3±0.8%。BCAC吸附靛蓝胭脂红符合准二级吸附动力学方程,推测该吸附主要为官能团共用或交换电子的化学吸附;对色氨酸的吸附符合准一级动力学方程,推测其吸附过程主要受某个单因素影响;BCAC对硫胺素的吸附过程不适用两种吸附模型;对单宁酸吸附效果较差。表征结果显示蒙脱石并未改变活性炭的化学性质,BCAC能保留大部分目标细菌的原因可能是蒙脱石与细菌均带负电,产生互斥效果。利用BCAC结合Rti-LAMP非预增菌快速检测蔬菜中的沙门氏菌,针对沙门氏菌inva基因序列设计特异性引物,以25 g的新鲜蔬菜为一份样品,将不同浓度的沙门氏菌滴加至蔬菜表面,利用4 g BCAC对25 m L蔬菜洗脱液前处理,吸附蔬菜中的抑制剂,经离心后的沉淀用0.5 m L 1×TZ裂解液重悬,混匀后在99.5℃金属浴加热10min,在12000 g离心5 min,上清液即为DNA模板,用于Rti-LAMP检测。结果表明,BCAC-Rti-LAMP检测生菜中沙门氏菌的灵敏度达2 CFU/g,相比Rti-LAMP的检测灵敏度提高10倍。此外,BCAC-Rti-LAMP检测模拟沙门氏菌污染的豆芽样品检出限达2 CFU/g,说明BCAC能有效吸附蔬菜中的抑制剂,提高检测灵敏度。此外,采用BCAC结合Rti-LAMP检测鸡蛋蛋壳表面的沙门氏菌,用生理盐水洗脱鸡蛋1 min后离心得到沉淀,沉淀经25 m L生理盐水重悬后,加入4 g BCAC在150rpm摇床处理15 min,提取DNA模板用于检测。结果显示Rti-LAMP方法与BCAC-Rti-LAMP方法灵敏度均达2 CFU/cm~2,推测因为实验选用的蛋壳相对干净,可不需要BCAC前处理。虽然鸡蛋壳表面无大量抑制剂影响检测,但由于无法鉴别死活细胞,引入4μg/m L的叠氮溴化乙锭(EMA)处理样品,暗反应5 min后在卤素灯下光照15 min,样品离心后用0.2 m L 1×TZ重悬,提取DNA模板用于Rti-LAMP检测。结果表明,EMA-Rti-LAMP方法能有效区分活、死细胞,检测活细胞与检测活、死细胞灵敏度均为2 CFU/反应,此时活细胞:死细胞比例为2:1998/反应。EMA-Rti-LAMP检测模拟沙门氏菌混合菌污染鸡蛋时灵敏度为10 CFU/cm~2,检测人工模拟VBNC状态的沙门氏菌污染鸡蛋检出限达4 CFU/cm~2。