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背景重症肌无力（Myasthenia gravis,MG）是一种由抗乙酰胆碱受体（Acetylcholine receptor,ACh R）、肌肉特异性激酶（Muscle-specific kinase,Mu SK）、低密度脂蛋白受体相关蛋白4（Low-density lipoprotein receptor-related protein 4,LRP4）或其他ACh R相关蛋白的抗体介导、T细胞依赖主要累及神经-肌肉接头突触后膜ACh R的自身免疫性疾病（Autoimmune disease,AID）,其确切的发病机制尚未明确。研究发现在系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）患者中检测到能够在体外抑制粒系-巨核细胞系集落形成单位（Colony forming units-granulocyte macrophage,CFU-GM）和红系集落形成单位（Burst forming units-erythroid,BFU-E）的血清自身抗体。活动期SLE患者骨髓基质细胞支持造血细胞生长能力低下,经过自体造血干细胞移植（Autologous hematopoietic stem cell transplantation,AHSCT）后基质细胞功能恢复,提示骨髓中自身反应性T淋巴细胞的存在可能是SLE患者的造血功能缺陷的原因。T淋巴细胞介导的细胞克隆生长抑制,甚至在多能祖细胞水平以及针对纤连蛋白的抗体都会影响细胞与基质细胞的相互作用。以上研究提示AID可能是一种造血干/祖细胞（Hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs）克隆障碍性疾病,骨髓造血微环境缺陷可能影响干/祖细胞生长。MG是神经系统中比较常见的AID,国内外对MG骨髓细胞的研究报道不多,主要集中于造血干/祖细胞的分离纯化、临床移植应用以及骨髓间充质干细胞动物模型移植治疗实验研究,关于CD34+HSPCs储备、增殖分化功能特性及骨髓基质细胞对其调控的研究极少,需要进一步研究。目的拟通过分析MG患者骨髓HSPCs免疫表型情况,研究骨髓CD34+HSPCs增殖分化特性,探讨MG患者骨髓HSPCs的生物学特性,同时初步了解骨髓基质细胞的生物学特点及对CD34+细胞的生长调节机制,研究MG的发病机理,评估MG自体干细胞移植治疗的临床应用提供理论基础和实验依据。方法（一）重症肌无力患者骨髓造血干/祖细胞分群研究1、将骨髓液经Ficoll淋巴细胞分离液分离获得骨髓单个核细胞（Bone marrow mononuclear cells,BMMNCs）。2、用PE-CD34和FITC-CD38抗体避光孵育BMMNCs后,经流式细胞仪检测进行干细胞亚群分析。（二）重症肌无力患者骨髓造血干/祖细胞体外培养1、将分离获得BMMNCs的用CD34免疫磁珠抗体孵育后经midi MACS分选获得纯化的CD34+HSPCs。2、对CD34+细胞在半固体培养基中进行短期2周培养,观察BFU-E、巨核细胞集落形成单位（Colony forming units-megakaryocyte,CFU-Meg）及CFU-GM形成情况。3、对BMMNCs进行长期培养,观察非贴壁有核细胞（Non-adherent cells,NACs）和集落形成细胞（Colony forming cells,CFCs）的形成情况,并进行PE-CD15、Per Cy5.5-CD14及APC-CD33抗体染色后流式细胞仪分析鉴定CFU-GM。（三）重症肌无力患者骨髓基质细胞对CD34+细胞调节机制的研究1、分离BMMNCs后用midi MACS分选CD34+造血干/祖细胞。2、对BMMNCs培养观察骨髓成纤维细胞的生长情况、倍增时间及成纤维细胞集落（Colony forming units-fibroblast,CFU-F）形成情况。3、对BMMNCs进行传代和纯化培养获得骨髓成纤维细胞,与同一对照CD34+细胞共培养,半固体培养法观察BFU-E、CFU-Meg及CFU-GM形成情况,长期培养法观察NACs和CFCs的情况。4、将MG组和对照组的骨髓成纤维细胞分别与同一对照CD34+细胞共培养后,收集培养物无细胞上清,用酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）干细胞因子（Stem cell factor,SCF）、基质细胞衍生因子-1α（Stromal cell derived factor-1α,SDF-1α）、FMS样酪氨酸激酶受体3配体（FMS-like tyrosine kinase 3 ligand,FL）的分泌情况,蛋白质印迹（Western blot,WB）检测SCF、SDF-1α、FL蛋白的表达。结果（一）重症肌无力患者骨髓造血干细胞分群研究1、CD34+、CD34+CD38+及CD34+CD38-细胞群数量在MG组显著低于对照（P<0.05）。亚组分型中发现眼肌型MG（Ocular MG,OMG）组CD34+、CD34+CD38+细胞群比例明显高于全身型MG（Generalized MG,GMG）组而低于对照组（P0.05）,但低于对照组（P<0.05）。2、胸腺瘤相关MG（Thymoma-associated MG,TAMG）组CD34+、CD34+CD38+及CD34+CD38-细胞群数量均明显高于无胸腺异常MG（MG without thymus abnormalities,MGWT）组,而显著低于对照组（P0.05）,但各组均显著低于对照组（P<0.05）。（二）重症肌无力患者骨髓造血干/祖细胞体外培养1、MG组CFU-Meg数显著高于对照组,而CFU-GM显著低于对照组（P<0.05）。OMG和TAMG组CFU-Meg分别显著低于GMG和MGWT组,CFU-GM分别显著高于GMG和MGWT组,且各组CFU-Meg均高于对照组,CFU-GM均低于对照组（P0.05）,但各组与对照组比较差异显著（P<0.05）。2、MG组长期培养BMMNCs的CFCs数量显著低于对照组（P<0.05）。培养四周后MG组NACs数开始显著减少（P<0.05）。经流式细胞学鉴定培养物上清细胞免疫表型发现MG组CD33+CD14+和CD33+CD15+细胞群数量均显著低于对照组（P<0.05）。OMG组和TAMG组CD33+CD14+和CD33+CD15+细胞群比例均分别显著高于GMG组和MGWT组,低于对照组（P0.05）,但均显著低于对照组（P0.05）。骨髓成纤维细胞生长曲线呈S线,但MG组倍增时间较对照组慢。2、无论是短期抑或是长期BMMNCs培养,MG组CFU-Meg、CFU-GM集落形成及NACs、CFCs数量均低于对照组（P0.05）。结论1、MG患者BMMNCs培养增殖分化功能障碍,骨髓CD34+细胞储备数量缺乏及向粒单系和巨核系分化异常,且与疾病严重程度、合并胸腺瘤相关,提示MG发病可能与干/祖细胞异常有关。2、在MG亚型分析研究中,无胸腺异常MG患者骨髓CD34+细胞储备数量及向粒单系和巨核系分化异常的程度较胸腺瘤相关MG患者明显缺陷,需进一步研究。3、MG患者骨髓基质细胞生长迟滞,分泌造血因子SCF、SDF-1α障碍,提示MG骨髓造血微环境功能可能存在异常。