研究背景毛囊的构成主要由表皮成分和真皮成分组成,而表皮和真皮间的相互作用决定了毛囊正常的形态发生、周期性循环和增殖再生的过程。表皮成分中主要成分是毛囊干细胞（hair follicle stem cell,HFSC）、毛母质、内外根鞘等,而真皮组织中的主要成分是真皮乳头细胞（dermal papilla cell,DPC）。在毛发的生长过程中,主要由真皮乳头细胞诱导表皮细胞分化出HFSC并向下生长包绕DPC,最后形成成熟的真皮乳头细胞。而这种成熟的真皮乳头细胞才能诱导毛母质,内外鞘,和毛囊干的分化,促进增殖生长。大量的研究表明,真皮乳头细胞在自身的增殖分化过程中不仅可以通过上皮-间质之间的信号调节毛囊的发育和生长,更重要的是其被认为是一种间充质干细胞,具有不同的分化潜能和诱导增殖的特性。间充质干细胞是一种多功能干细胞,在特定的微环境中可以向其他类型细胞进行增殖分化。真皮乳头细胞从毛囊微环境中分离出来进行体外培养时,由于培养环境的改变,信号刺激的消失,逐渐失去干细胞活性和增殖能力,但是如果有相应的信号或细胞因子刺激,真皮乳头细胞仍有其固有的诱导分化的能力。因为真皮乳头细胞的毛发诱导能力对于毛囊的生长有着重要意义,所以如何在体外微环境下培养出真皮乳头细胞并让其具有增殖、分化能力受到人们广泛关注。在体外低氧环境的刺激下,间充质干细胞的增殖、分化能力能不同程度的增强。由此可见低氧对于干细胞的活性起着非常重要的作用。细胞在增殖分化过程中主要在细胞质中通过糖酵解的方式将葡萄糖转化成丙酮酸,然后在线粒体中进行丙酮酸氧化作用（三羧酸循环）。而在低氧条件下,丙酮酸主要在细胞质中通过乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）转化成乳酸,为细胞的增殖和分化提供能量。细胞培养也已经证实,乳酸脱氢酶作为糖酵解过程中的一个关键酶,能够促进毛囊干细胞的活性,诱导毛囊的生长。但是,目前我们仍不清楚体外低氧条件下对真皮乳头细胞的增殖水平,以及其在细胞代谢过程中乳酸脱氢酶的表达情况。毛囊器官培养模式在一定程度上模拟了体内毛囊的生长环境和真皮乳头细胞的体内三维立体结构,延长体外培养时的诱导能力,从而了解参与调节毛发生长的一些重要细胞因子和代谢物质,同时可掌握毛囊体内生长的一些重要信号传导通路（比如:Wnt/β-catenin通路）及调控机制,对明确细胞与细胞之间或者细胞与基质之间的相互作用重要的意义。生物信息学研究发现真皮乳头细胞在体外培养时其相应的基因表达会发生变化,与之相对应的蛋白水平也会产生变化,导致其固有特性改变,特别是毛发的诱导能力和细胞聚集能力。其中基因表达改变最明显的就包括有c-Myc基因,c-Myc基因作为乳酸脱氢酶的上游调控基因,可以调控乳酸脱氢酶的表达,从而诱导毛囊周期循环,促进毛囊再生。与传统细胞培养方式相比,毛囊器官培养在毛囊生长周期和细胞代谢途径上能更好的反应体内微环境的变化给毛囊生长带来的影响。虽然,目前的毛囊器官培养基还不能完全等同于体内毛囊生长的真实环境,但是利用毛囊器官体外培养的模型,我们可以研究不同的微环境和药物浓度的改变对真皮乳头细胞增殖活力和分化诱导能力的影响。因此,本实验从两个方面进行探究,一方面是我们通过体外细胞培养环境的改变,初步了解低氧对真皮乳头细胞增殖能力影响,为其保留间充质干细胞的活性提供良好的培养环境。同时,从细胞代谢水平及代谢产物的变化探讨乳酸脱氢酶对真皮乳头细胞和毛囊再生的影响。另一方面,通过毛囊器官培养的方式,进一步证实乳酸脱氢酶对毛囊生长的促进作用。本研究的结果为毛囊再生领域和毛发移植过程中提高毛囊器官的存活率提供一定的理论依据和临床意义。第1部分低氧环境下乳酸脱氢酶对真皮乳头细胞增殖的诱导影响目的:低氧对维持干细胞增殖和分化能力具有重要意义。真皮乳头细胞（DPC）作为毛囊（hair follicle,HF）的一种特殊间充质成分,不仅调节毛囊的发育和生长,而且被认为是一种潜在的多功能干细胞。因此,这部分实验重在探讨低氧是否能维持真皮乳头细胞的增殖能力,并研究在低氧环境下诱导乳酸脱氢酶（LDH）的活性改变对真皮乳头细胞增殖的影响。方法:采用显微分离技术结合酶消化法获取真皮乳头细胞,重悬后调整细胞密度至1×10~6/ml,接种于透气型塑料培养瓶中,分别在正常氧浓度（20%O2）或低氧（5%O2）浓度条件下进行体外细胞培养,并观察其形态学和生长方式变化。选取生长良好的真皮乳头细胞,以每孔4×10~3个细胞/100μl培养基接种于96孔板中。实验分为低氧浓度组（5%O2）和正常氧浓度组（20%O2）,分别取6h、12h、24h、48h、72h、5个时间节点用CCK-8法来观察和检测真皮乳头细胞的增殖情况,每次每组各取3个复孔观测;同时用ELISA检测真皮乳头细胞中乳酸脱氢酶活性和乳酸水平。最后,用不同浓度的乳酸脱氢酶（1-10μg/ml）处理真皮乳头细胞24小时。通过免疫荧光染色和Western blotting评估各组DPC中蛋白标记物（ALP、β-catenin和LEF-1）的表达。结果:低氧对真皮乳头细胞的增殖有促进作用。细胞形态学显示:在低氧状态下培养24小时后,真皮乳头细胞贴壁更早,细胞增殖速度更快。细胞增殖活力检测表明:在培养的前12小时内两种不同的氧浓度刺激下细胞均有所增殖,但低氧环境下培养的真皮乳头细胞增殖速度更快;在培养的第24小时,低氧环境下的细胞增殖速度明显高于正常氧浓度组,有统计学差异（P<0.05）。同时对真皮乳头细胞中乳酸脱氢酶活性检测发现:在培养的前24小时,低氧条件下培养的乳酸脱氢酶活性明显高于正常氧浓度组,差异具有统计学意义（P0.05）。用不同浓度的乳酸脱氢酶处理真皮乳头细胞后,5和10μg/ml乳酸脱氢酶处理的真皮乳头细胞中,相关毛囊诱导蛋白（ALP、β-catenin和LEF-1）的表达水平明显升高,与空白对照组相比均有显著性差异（P<0.05）。结论:本研究表明低氧条件下可维持真皮乳头细胞的增殖能力,同时从细胞代谢角度揭示了低氧刺激能增强真皮乳头细胞中乳酸脱氢酶的活性,使得细胞标志物蛋白表示升高,促进DPC的增殖。未来需要更进一步的研究来证实低氧如何维持真皮乳头细胞的细胞特性以及乳酸脱氢酶促进细胞增殖能力的机制。如果可能的话,这将为真皮乳头细胞的体外干细胞培养提供新的思路和技术。第2部分乳酸脱氢酶在小鼠毛囊中的表达及对毛囊生长的影响目的:乳酸脱氢酶（LDH）是糖酵解代谢中重要的限速酶,在毛囊干细胞的生长中起着重要作用。然而,在毛囊生长过程中乳酸脱氢酶的确切表达和相关的信号通路尚未确定。本研究通过毛囊器官培养模型,进一步证实乳酸脱氢酶是否能促进毛干的生长,并通过毛囊经典的Wnt/β-catenin信号通路探究真皮乳头细胞的生物学特性。方法:选取4周雌性野生型C57BL/6J小鼠10只,分别将处于不同毛囊增殖周期的小鼠背毛分离出来进行免疫组织化学,观察乳酸脱氢酶在真皮乳头细胞内和毛母质细胞区域表达情况。构建小鼠毛囊器官培养模型,在体视显微镜下分离小鼠触须垫中的毛囊器官结构,并从中选择处于增殖期的毛囊进行体外培养。毛囊器官分别放入24孔细胞培养板中进行培养。每次实验将24根毛囊器官随机分成4组,每组分别加入不同浓度的乳酸脱氢酶（1、5、10μg/ml）和不加乳酸脱氢酶的空白对照组共培养3天。试验共重复3次。观察毛囊毛干的生长长度和生长周期的变化。同时为了追踪毛囊生长过程中毛母质细胞的增殖情况,采用Ki-67和TUNEL双荧光染色法评价各组中增殖细胞和凋亡细胞变化。将培养良好的真皮乳头细胞用5和10μg/ml乳酸脱氢酶处理24小时后,通过蛋白免疫印迹分析真皮乳头细胞相关蛋白和Wnt/β-catenin信号通路蛋白的表达情况。最后,选取10只同窝雌性C57BL/6J小鼠。脱毛后,小鼠被随机分为空白对照组和实验组,通过皮下注射法在实验组小鼠背毛区域注射100μl DMEM（内含5μg/ml乳酸脱氢酶）,空白对照组注射同样剂量未含乳酸脱氢酶的DMEM培养基。在第0、7、14、28天分别拍照获取图像。同时取小鼠背毛皮肤标本,进行苏木精和伊红（HE）染色,对比观察小鼠背毛生长情况。结果:通过免疫组化,我们观察到处在不同生长周期的毛囊,其乳酸脱氢酶的表达部位和强度均有所不同。在毛囊的增殖期（anagen）阶段,乳酸脱氢酶主要在真皮乳头细胞内和毛母质区域高表达。毛囊器官培养3天后发现,与对照组（不含乳酸脱氢酶）相比,5μg/ml乳酸脱氢酶处理组能显著促进毛干的生长（P<0.05）。同时行Ki-67和TUNEL双荧光染色实验发现,用5和10μg/ml乳酸脱氢酶培养毛囊72小时后,毛母质细胞的增殖活力与对照组相比明显增加（P<0.05）。蛋白免疫印迹（Western blotting）检测对照组、5和10μg/ml乳酸脱氢酶处理组中蛋白表达的情况,在空白对照组中,真皮乳头细胞中的ALP和LEF-1蛋白的表达较低,但是在5μg/ml乳酸脱氢酶刺激后这两种蛋白的表达明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。在Wnt/β-catenin信号通路中,Wnt5a和β-catenin两种信号蛋白在5μg/ml乳酸脱氢酶刺激后同样表达也显著增强,差异有统计学意义（P<0.05）。最后,通过小鼠体内实验验证。与对照组相比,乳酸脱氢酶确实能诱导毛囊更早的进入增殖期,加速毛囊周期由静止期（telogen）向生长期（anagen）转变。在小鼠背毛生长的第7天和14天,5μg/ml乳酸脱氢酶处理组中小鼠背毛皮肤厚度与对照组相比显著增加（P0.05）。结论:通过毛囊器官培养,我们证实了乳酸脱氢酶可以促进毛囊体外生长。乳酸脱氢酶能够诱导真皮乳头细胞的生物学特性,并有可能通过Wnt/β-cantenin信号通路促进毛干生长,诱导毛囊提前进入增殖期。目前关于乳酸脱氢酶诱导毛囊增殖仅在动物实验中得到验证,其具体的信号传导通路和机制有待进一步的证实。同时,本研究为下一步研究证实乳酸脱氢酶对人真皮乳头细胞起到同样的增殖分化效果提供实验依据。