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研究背景及目的 生物膜离子通道（ion channels of biomembrane）是各种离子跨膜运输的通路,它是由细胞产生的特殊蛋白质构成。生物膜对离子的通透性与多种生命活动过程密切相关,例如,感受器电位的发生、神经兴奋与传导、各种反射活动以及心脏搏动、平滑肌蠕动、骨骼肌收缩、激素分泌等。细胞膜离子通道有多种,如钾通道、钠通道、钙通道、氯通道、乙酰胆碱依赖性通道等等,其中的钾通道又包括多种：延迟整流钾通道（delayed rectifying potassium）,钙激活钾通道（Calcium-activated potassium channal）,内向整流的钾通道（inwardly rectifying potassium）。本文研究的小电导钙激活钾通道（Small-conductance Calcium-activated potassium channal）是钙激活钾通道的一种,在可兴奋细胞中发挥着重要作用,其中SK2对蜂毒明肽（apamin）比其他三种亚型敏感,具有K+选择性,Ca2+高度敏感性和电压非依赖性等特征。SK2通道分布广泛,如中枢神经系统、平滑肌、人和小鼠的心肌等组织,在心肌中心房肌的表达高于心室肌。 心肌细胞SK2通道作为钙激活的钾通道对胞浆中的钙离子具有高度敏感性,细胞内的Ca2+浓度升高时,SK2通道激活,K+外流,参与动作电位复极化的完成,由此可见细胞内Ca2+信号对通道的激活至关重要。细胞内Ca2+来源主要由两条途径获得：细胞膜电压门控Ca2+通道（Voltage-gated Ca2+ channels VGCCs）及内质网膜上的Ryanodine受体（ryanodine receptors, RyRs）,后者是存在于真核生物细胞肌浆网（Sarcoplasm icreticulum, SR）上的一种细胞内Ca2+释放通道。哺乳类动物组织中已鉴定出RyRs的3种亚型,分别是RyR1（ryanodine receptor type 1）, RyR2（ryanodine receptor type 2）和RyR3（ryanodine receptor type3）。RyR2主要存在于心肌细胞,位于细胞的SR。RyRs是细胞内最为主要的Ca2+释放通道,通过释放SR内的Ca2+来调节细胞内的Ca2+浓度。其主要作用机制是钙离子诱导的钙释放（Ca2+induced Ca2+release, CICR）,当心肌细胞去极化时,细胞膜上的L型Ca2+通道（L-Calcium channels, LCCs）开放,少量的Ca2+内流,使胞浆中Ca2+浓度单位时间内迅速升高,Ca2+与SR上的雷尼丁受体（ryanodine receptor 2, RyR2）结合并使其开放,导致大量的Ca2+从SR中释放入胞浆,此过程即为钙诱导的钙释放（Ca2+ -induced Ca2+ release, CICR）.它为骨骼肌和心肌收缩提供肌质网Ca2+,直接参与心肌的兴奋-收缩耦联过程,RyR2的激活可使细胞内钙离子迅速增加,其Ca2+浓度可快速增高至10倍以上。 已有工作表明心肌细胞L-型Ca2+通道与SK2通道具有功能性耦联。RyRs-Ca2+释放通道,SK2通道及电压-门控Ca2+通道在功能上与细胞内Ca2+信号密切相关。心房细胞中RyRs-Ca2+释放通道是否影响SK2通道的功能?国内外尚未见报道。此外,心房细胞SK通道的分子的调控途径也尚未明确。本研究对RyRs-Ca2+释放通道是否影响心房细胞SK2通道进行了初步探讨,为进一步探讨SK2通道的电生理功能及其与心律失常发生机制关系的研究奠定坚实的理论基础,为临床治疗房性心律失常提供新思路。 方法 1.实验动物：健康的成年（16-22W） C57BL/6J小鼠,体重20-25g,雌雄不拘,购于郑州大学实验动物中心。 2.急性分离小鼠心房细胞：将小鼠麻醉,打开胸腔行主动脉插管,主动脉根部逆行插管成功后置于Langendorff装置上进行恒温恒速灌流。灌流液分别为无钙台氏液,酶消化液和高钾液,酶消化液由Ⅱ型胶原酶、蛋白酶、氯化钙和牛血清白蛋白溶于无钙台氏液中所得。急性分离小鼠心脏得到单个心房细胞。 3.应用全细胞膜片钳技术记录不同药物作用于细胞时SK2通道在不同电压（-120～60mV）下的电流变化。 4.统计处理：所有数值用均数±标准误表示,使用pulse 8.67软件记录和分析通道电流,采用Origin6.0来制图,数据统计使用SPSS 13.0软件,统计学处理用单因素方差分析法。检验水准α=0.05。 结果 1.急性分离心房细胞时得到边缘清晰的梭形细胞。 2.从电流密度-电压曲线上可以看出通道电流随着电压升高反而降低,与时间无关,具有内向整流的特征,反转电位约-73mV,符合Nernst方程。 3.SK2通道电流可以被apamin阻断。加入激动剂咖啡因可以使SK2通道电流增大,而加入抑制剂Ryanodine和Thapsigargin可以使SK2通道电流明显降低,在部分电压下经检验有统计学意义。这说明改变RyR2通道状态时,SK2通道功能状态随之改变。 结论 RyR2钙释放受到调节时SK2通道电流可以发生相应的变化,SK2通道和RyR2钙释放之间可能存在功能性耦联。