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贯叶连翘（Hypericum perforatum L.）为金丝桃科（Hypericaceae）多年生草本植物,其作为一种重要的药用植物,全草皆可入药。贯叶连翘具有多种生物活性成分,其中,以褪黑素（melatonin）、金丝桃素（hypericin）和贯叶金丝桃素（hyperforin）为主的药用成分可用于治疗轻到中度抑郁症,且具有耐受性好、副反应少等优势。褪黑素（N-乙酰基-5-甲氧基色胺）是一种色氨酸的衍生物,其作为贯叶连翘中一种高含量的主要活性成分,发挥着重要的生理作用。5-羟色胺-N-乙酰基转移酶（serotonin N-acetyltransferase,SNAT）是参与植物褪黑素生物合成途径中的关键酶,已有研究表明,水稻、拟南芥和苹果等植物中的SNAT蛋白酶均能催化褪黑素及其前体物质的合成,且过表达SNAT基因后能够使得植物体内褪黑素的含量升高进而增强其植株的胁迫耐受性。然而,贯叶连翘SNAT基因是否参与调控其褪黑素的合成?是否具有相同的分子机制尚不清楚。本研究基于贯叶连翘全基因组数据,对贯叶连翘SNAT家族的成员进行生物信息学、表达模式和原核表达分析,初步筛选出参与贯叶连翘褪黑素生物合成且响应干旱胁迫的关键酶基因HpSNAT1和HpSNAT2;其次,分别在拟南芥和贯叶连翘体内对其基因的相关功能进行深入探究。主要研究内容和结果如下:1.基于贯叶连翘全基因组数据库,共鉴定出48个SNAT家族的成员,通过与模式植物拟南芥和水稻中功能已知蛋白AtSNAT1（AT1G32070）、AtSNAT2（AT1G26220）、OsSNAT1（AK059369）和 OsSNAT2（AK068156）进行系统进化树、多序列比对和保守基序分析,得出贯叶连翘中的evm.model.scaf151.204（HpSNAT1）和 evm.model.scaf64.495（HpSNAT2）与 AtSNAT 和 OsSNAT 的亲缘关系最近。多序列比对分析表明它们同源性较高,且含有相似的的保守基序,进而推测这些基因可能具有类似的功能,HpSNAT1/2基因可能在贯叶连翘褪黑素合成途径中起着关键的作用。2.通过基因克隆得到了贯叶连翘HpSNAT1/2基因的CDS全长,其长度分别为516 bp和1,332 bp,分别编码171和443个氨基酸。生物信息学分析的结果表明这两个蛋白均不含信号肽和跨膜结构域,都属于亲水性蛋白。表达模式分析结果表明HpSNAT1/2均在贯叶连翘地上部分高表达,并对非生物胁迫盐和干旱具有一定的响应。拟南芥原生质体瞬时转染实验表明HpSNAT1/2蛋白均定位于叶绿体中。3.将HpSNAT1/2基因构建到原核表达载体上,但仅成功诱导并提取出了一条目的蛋白HpSNAT1,其大小约为19 kDa。实验结果表明,HpSNAT1蛋白为可溶性蛋白,且在IPTG终浓度为1 mM,16℃,180rpm的条件下,诱导20h后蛋白的表达量最高,进一步提取并纯化出了浓度约为1690 μg/mL的GST-HpSNAT1融合蛋白,为HpSNAT1的体外功能研究奠定了基础。4.利用Gateway重组技术构建了HpSNAT1/2基因的过表达载体,通过拟南芥互补试验验证了基因的功能:利用根癌农杆菌介导的转化法浸染拟南芥snat突变体,然后经分子水平的鉴定与半定量分析筛选出了 3个高表达的snat-HpSNAT1/2纯合株系。通过对拟南芥褪黑素含量及抗旱指标检测发现:与snat相比,转基因回复突变株系中褪黑素含量约为snat的1.86-2.22倍;干旱和盐处理后,转基因拟南芥在叶片颜色、侧根数目、长势等表型方面均优于snat,且其体内的ROS、MDA以及H2O2含量相对较低,表现出更强的抗旱性。上述结果表明,贯叶连翘HpSNAT1/2基因不仅提高了拟南芥内源褪黑素的含量,促进了植株根系的生长,而且还能够有效地清除活性氧（ROS）和降低植株MDA以及H2O2的含量,进而增强植物的耐旱性。5.通过根癌农杆菌介导的转化法浸染贯叶连翘根部外植体,获得了 5个HpSNAT1/2转基因株系,并进一步将HpSNAT1/2高表达的阳性毛状根株系成功诱导成完整的贯叶连翘转基因植株。对转基因株系进行含量检测发现:HpSNAT1/2过表达植株中褪黑素及其前体物质的含量均显著提高,约为WT的2-4倍,表明这两个基因均参与了贯叶连翘中褪黑素及其前体物质的合成。进一步对贯叶连翘褪黑素合成途径上关键酶基因HpASMT1/3的表达量进行检测,结果显示过表达HpSNAT1/2基因会使关键酶基因ASMT的表达上调,进一步提高了贯叶连翘植株中5-MT和褪黑素的含量。由此可见,HpSNAT1/2在贯叶连翘褪黑素生物合成途径中发挥着至关重要的作用。综上所述,本研究首次对贯叶连翘SNAT家族成员进行鉴定与分析,不仅明确了HpSNAT基因对贯叶连翘和拟南芥褪黑素合成的影响,而且也初步揭示了其基因对拟南芥植株响应干旱胁迫的调控机制,为进一步探究SNAT基因的具体功能及褪黑素调控贯叶连翘植株生长发育及胁迫响应的分子机制提供了重要依据。此外,贯叶连翘转化体系的成功建立为后续探究贯叶连翘中关键酶基因以及转录因子功能奠定了基础。