猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是目前危害全球猪养殖业的疾病之一,由PRRS病毒（PRRSV）感染引起。其症状为母猪厌食发热、呼吸系统障碍、妊娠后期发生流产、产死胎和木乃伊胎,仔猪发生呼吸系统疾病和大量死亡。该病对我国养猪行业造成巨大损失。由于目前没有有效药物,且现有的疫苗免疫效果不理想,特别是疫苗毒株和野毒重组形成新的变异毒株,使得该病的防控异常艰巨。中和抗体作为一种精确高效的杀伤病毒的抗体,在兽医临床中具有重要的诊疗作用。PRRSV中有许多病毒蛋白可诱导机体产生中和抗体,其中结构蛋白GP3含有中和抗体表位,GP3被认为与机体保护性免疫有关。本研究通过制备GP3单克隆抗体,研究其病毒中和活性,表达具有中和活性的单链抗体,对PRRSV进一步的研究提供有利的工具,为PRRS的防控奠定基础。本研究共分为三个内容:（1）PRRSV GP3蛋白的原核表达与蛋白纯化和复性首先将PRRSV TA-12株的GP3基因使用双酶切连接的方法克隆到pET-32a空载体上,经转化DH5α感受态细胞,提取菌液PCR阳性的质粒和双酶切验证,构建好pET-32a-GP3重组质粒。测序鉴定后转化到BL21感受态细胞中并进行诱导表达,经SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白凝胶考马斯亮蓝染色验证分析,PRRSV GP3重组蛋白呈不溶性表达,大小约为35 kDa,再通过Ni-NTA亲和层析柱方法纯化GP3重组蛋白,运用尿素梯度透析法复性纯化的PRRSV GP3重组蛋白,检测蛋白浓度。由此获得用于免疫小鼠的免疫原。（2）PRRSV GP3蛋白单克隆抗体的制备与抗体病毒中和作用复性的GP3蛋白SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白凝胶考马斯亮蓝染色验证,BCA法检测蛋白浓度,达到免疫浓度后对3只7周龄雌性Balb/C小鼠进行免疫,三次免疫后在小鼠尾静脉采血,取血清通过间接ELISA试验检测小鼠血清抗体水平,小鼠血清达到细胞融合条件后对小鼠进行加强免疫,三天后取小鼠脾细胞与培养的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞,通过化学法加入融合剂聚乙二醇（PEG）对两种细胞进行融合。细胞融合14 d之后以表达的GP3蛋白作为抗原,包被ELISA酶标孔,通过间接ELISA试验对融合细胞上清进行抗体检测,筛选能够分泌抗体的阳性杂交瘤细胞,在经过三次亚克隆获得既能够分泌抗体又能够无限传代的两株杂交瘤细胞,命名为GP3-8B7和GP3-7B3。经间接免疫荧光试验（IFA）和Western Blot试验验证了这两株GP3单克隆抗体的特异性。GP3抗体的两株杂交瘤细胞按相应的细胞数量注射到经产Balb/C小鼠体内,制备了GP3单克隆抗体。获取的两株GP3单克隆抗体保存在-80℃超低温环境中。固定每细胞孔中病毒量为0.1个MOI。2倍稀释GP3单克隆抗体,病毒与不同稀释度的抗体按照1:1比例混合,在37℃的条件下作用1 h,将混合液接种到长满单层的Marc-145细胞上,于37℃的条件下作用2 h,同时设置对照（小鼠免疫前保存的阴性血清按照2倍稀释,与病毒混合后感染细胞）和（小鼠融合前保存的阳性血清按照2倍稀释,与病毒混合后感染细胞）。2 h后更换维持液,逐天观察细胞病变,待3 d左右细胞状态稳定,通过IFA试验观察荧光情况来检测GP3单克隆抗体对PRRS病毒中和的效果结果显示阴性血清无中和病毒的作用,GP3小鼠阳性血清具有中和病毒的作用,效价为2~3,GP3-8B7和GP3-7B3两株单克隆抗体的病毒中和效价均为2~5。（3）GP3单链抗体的制备与抗体病毒中和作用为了使得抗体更易大量获取,使抗体最小化。通过扩增GP3单克隆抗体中可变区轻链与重链,人为加入连接肽（Linker）将GP3单克隆抗体的轻链可变区（L）和重链可变区（H）与pET-28a-sumo空载体构建成重组基因。经双酶切验证和测序结果比对,最终成功构建GP3-8B7与GP3-7B3单链抗体基因。通过原核表达的方法获得蛋白,GP3单链抗体蛋白分子量为54 kDa。SDS-PAGE凝胶电泳验证其为不可溶性表达,获得的两株GP3单链抗体蛋白经过纯化和复性,通过SDS-PAGE凝胶电泳验证复性效果,BCA法检测其蛋白浓度。使用带有GFP标签的PRRSV毒株,固定每细胞孔病毒的量。蛋白按照2倍稀释后等比例与PRRS病毒混合,进行与检测单克隆抗体病毒中和试验相同的操作。3 d左右细胞逐渐状态稳定,直接在倒置荧光显微镜下观察。结果发现GP3-8B7单链抗体病毒中和效价为2~3,GP3-7B3单链抗体病毒中和效价为2~2。综上所述,本研究通过获得针对PRRSV GP3蛋白的两株中和抗体,原核表达了这两株单克隆抗体的单链抗体,制备的单链抗体具有较好的中和活性,研究结果可为PRRS的防控奠定基础。