论文部分内容阅读
本论文分为两大部分:第一部分:Notch1与PKC ζ在胶质瘤中表达相关并参与胶质瘤进展第二部分:ITSN1-S的SH3结构域调控胶质瘤细胞的增殖和运动第一部分目的前期研究表明Notch1-MMP和PKCζ-MMP信号通路调控肿瘤的恶性进展,此外,这两种通路均参与肿瘤细胞的迁移和侵袭。但是,在人脑胶质瘤中有关Notch1-MMP和PKCζ-MMP信号通路的相互作用尚未见报道。因此,本文旨在探讨胶质瘤中Notch1、PKC ζ、MMP2和MMP9表达的意义以及四种蛋白表达的相关性,进而揭示Notch1信号通路和PKC ζ信号通路在胶质瘤恶性进展中的潜在作用。方法1.收集我院103例胶质瘤标本,整理临床病例资料,并对入选患者进行随访。2.选取的胶质瘤级别Ⅰ-ⅣV级,通过免疫组织化学的方法染色,染色指标为Notch1、PKCζ、MMP2 和 MMP9。3.观察Notch1、PKC ζ、MMP2和MMP9在癌旁组织及胶质瘤中表达差异。4.利用SPSS统计学软件分析四个蛋白及各病理参数之间的相关性。5.结合临床病理指标探讨它们在胶质瘤发生发展中的作用及对临床预后的影响。结果1.Notch1和PKC ζ定位在人脑胶质瘤细胞质和细胞核,MMP2和MMP9主要定位在人脑胶质瘤细胞质,阳性率分别为Notch1(77/103;74.76%),PKCζ(57/84;67.86%),MMP2(72/103;69.90%)和 MMP9(49/103;47.57%)。2.Notch1的表达与PKC ζ、MMP2和MMP9表达呈正相关,PKC ζ表达与MMP9表达呈正相关,而MMP2和MMP9之间无相关性。3.Notch1和PKC ζ在人胶质母细胞瘤中的表达水平明显高于其他低级别胶质瘤,MMP2和MMP9在高级别胶质瘤中的表达水平明显高于低级别。4.单因素生存分析表明Notch1、PKCζ、MMP9、组织分级、病理类型和家族病史预示患者总体生存时间缩短。PKCζ、MMP2、MMP9、组织分级和病理类型预示患者无进展生存时间缩短。5.在多因素生存分析中,Notch1、PKCζ和组织分级是患者总体生存和无进展生存的独立预后指标。结论1.免疫组化实验表明Notch1和PKC ζ定位在人脑胶质瘤细胞质和细胞核,MMP2和MMP9主要定位在人脑胶质瘤细胞质,2.本研究首次证实在胶质瘤中Notch1表达与PKC ζ及其下游蛋白MMP2和MMP9表达呈正相关,PKC ζ表达与其下游蛋白MMP9表达呈正相关。3.多因素生存分析表明Notch1、PKCζ和组织学级别是胶质瘤患者的独立预后指标。4.本研究首次阐明了 Notch1的表达与PKCζ及其下游蛋白MMP9表达呈正相关,并且都影响胶质瘤患者的预后。因此,推测Notch1和PKCζ之间可能存在调控关系,进一步调节MMP9的表达,并且影响胶质瘤的恶性进展。第二部分目的ITSN1(Intersectin1)是一种进化上高度保守的多功能支架蛋白,本实验室前期研究表明ITSN1-S的表达与胶质瘤级别呈正相关,与病人的预后呈负相关。ITSN1-S调节胶质瘤细胞的迁移和MMP2表达,进而增强胶质瘤细胞的侵袭能力。且ITSN1-S的SH3结构域能够与多种在细胞骨架重排和信号转导中发挥重要作用的蛋白相结合。因此,本研究旨在进一步探索ITSN1-S的SH3结构域对恶性胶质瘤细胞LN229增殖和运动能力的影响。方法1.构建ITSN1-S的全长和EH1-EH2-CC片段慢病毒表达质粒:将ITSN1-S的全长和去除SH3结构域的片段(即EH1-EH2-CC片段)分别连接入双酶切后线性化的PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体中作为实验组,用PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro 载体作为对照组。2.通过慢病毒转染技术将上述ITSN1-S的全长、EH1-EH2-CC片段和空载体对照三个重组质粒转染进入LN229细胞。3.通过Western b1otting技术验证其表达效率,并筛选出稳定表达的克隆。4.利用MTT实验检测连续培养6 d各组胶质瘤细胞的增殖情况。5.利用软琼脂克隆形成实验检测连续培养2周的各组胶质瘤细胞克隆形成能力。6.利用划痕实验检测各组胶质瘤细胞在0,3,6,9,12,24h的非定向运动能力。结果1.经酶切和测序鉴定ITSN1-S的全长、EH1-EH2-CC片段和空载体对照三个重组质粒构建正确。2.胶质瘤细胞株LN229经慢病毒分别感染ITSN1-S的全长、EH1-EH2-CC片段和空载体对照三个重组质粒后,蛋白的表达水平都明显升高。3.MTT实验证明ITSN1-S全长组细胞的增殖能力比EH1-EH2-CC片段组和空载体对照组显著增强(<0.05),但EH1-EH2-CC片段组和空载体对照组两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。第6天时ITSN1-S全长组、EH1-EH2-CC片段组和空载体对照组细胞增值率分别为(523.60 ± 32.12)%、(409.54 ± 31.33)%和(353.89 ± 13.98)%。4.软琼脂克隆形成实验证明ITSN1-S全长组细胞的增殖能力比EH1-EH2-CC片段组和空载体对照组显著增强(P<0.05),但EH1-EH2-CC片段组和空载体对照组两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。第14天时ITSN1-S全长组克隆形成率达(46.49 ± 2.34)%,而EH1-EH2-CC片段组和空载体对照组克隆形成率分别为(23.00 ± 1.66)%和(17.68 ± 3.47)%。5.划痕实验12 h时ITSN1-S全长组细胞的运动速度比EH1-EH2-CC片段组和空载体对照组明显提高(P<0.05),但EH1-EH2-CC片段组和空载体对照组两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。24 h时ITSN1-S全长组运动距离为(0.39 ± 0.02)mm,EH1-EH2-CC片段组和空载体对照组分别为(0.30 ±0.02)mm 和(0.29 ±0.01)mm。结论与EH1-EH2-CC片段组和空载体对照组比较,ITSN1-S过表达导致胶质瘤细胞的增殖能力和运动能力显著增强,说明ITSN1-S中SH3结构域可能是影响胶质瘤细胞增殖能力与运动能力的主要功能结构域。