论文部分内容阅读
肠外致病性大肠杆菌（Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC）是一类重要能引起肠道以外器官疾病的病原菌,其特点是携带的一些特别的毒力基因使本菌能够侵入宿主的非消化道器官定植并诱导疾病的产生,肠外致病性大肠杆菌能无临床症状的寄居在宿主消化道,且能与共栖大肠杆菌一同寄居,有时甚至是优势菌株～20%,但不能与肠道致病大肠杆菌菌株一同寄居。一般来说只有共栖大肠杆菌和肠外致病性大肠杆菌能够引起宿主的肠外疾病。ExPEC感染动物机体后不仅引起肠道外感染,而且会引起机体的天然免疫应答反应,激活包括干扰素在内的多种细胞因子的表达,同时激活其它一些细胞因子如趋化因子RANTES的表达,从而增加细菌在动物体内定殖存活的机率。但ExPEC是通过何种机制来激活RANTES的表达目前尚不清楚,鉴于此,本研究以本实验室从猪肾中分离的一株血清型为O11的肠外致病性大肠杆菌E044株（ExPEC E044）为研究对象,对其耐药性、致病性、携带质粒的特性以及激活RANTES产生的机制进行了初步研究。具体研究内容如下:1.ExPEC E044株的耐药性用猪场常用的6种不同类型的抗生素和1种不常用的抗生素对ExPEC E044株进行了最小抑菌浓度（MIC）试验,结果表明该菌对6种常用的抗生素（阿米卡星、氨苄青霉素、四环素、环丙沙星、甲氧苄氨嘧啶、磺胺嘧啶）均具有很强的抵抗力,特别是对氨苄青霉素的抗性高达2560 ug/mL,而对不常用的头孢噻肟敏感。2.ExPEC E044株携带质粒的分离、测序及对细菌毒力的影响从ExPEC E044株中分离到了两个质粒pEC044a（5070bp）和pEC044b（6524bp）,测序后通过NCBI网站Blast工具比对核酸序列和ANTHEPROT网站分析蛋白序列发现质粒携带有潮霉素抗性基因,潮霉素B激酶基因,四环素抗性基因,变异表面糖蛋白基因（VSG）,铁传递蛋白异二聚体亚单位基因,IgG Fc-binding糖蛋白基因的同源基因。这些同源基因的存在说明本菌所携带的质粒可能与其抗性和毒力相关,这为进一步研究本菌的致病性打下了基础。ExPEC E044株在麦康凯琼脂培养基上生长成单菌落后,放置于4℃15天左右所携带的质粒发生丢失现象,为检测质粒与细菌毒力的相关性,将质粒丢失前后的菌株分别经腹腔接种昆明小鼠,测得质粒丢失前后菌株的LD50分别1×103.92CFw和1×105.36CFU,相差26倍,质粒丢失后菌株的毒力显著下降。3.ExPEC E044株激活RANTES的分子机制利用RANTES启动子全长序列的荧光素酶报告质粒pCCL5-PGL3证实ExPECE044菌株感染PK-15细胞后能激活RANTES的表达,为了揭示ExPEC E044激活RANTES表达的分子机制,构建了分别缺失RANTES启动子CRE结合位点上游序列、CRE、CRE+IRSE及CRE+IRSE+NF-IL6 4种不同突变体的荧光素酶报告质粒pCCL5-220-PGL3、pCCL5-168-PGL3、pCCL5-118-PGL3、pCCL5-80-PGL3,转染PK-15细胞后与ExPEC E044共培养,荧光素酶活性检测发现3个包含CRE缺失的突变体的荧光素酶活性较仅缺失CRE结合位点上游序列的突变体的荧光素酶活性要高,说明NF-κB结合位点在RANTES的激活中可能是一个关键的位点,而CRE可能负调控RANTES的表达。