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本论文以詹氏丙酸杆菌(Propionibacterium jensenii ATCC4868)为出发菌株，通过代谢工程和发酵优化手段提高其发酵合成丙酸产量。筛选获得一株丙酸杆菌属内源野生质粒并进行测序和分析，利用筛选的野生质粒构建詹氏丙酸杆菌-大肠杆菌穿梭表达系统，并进行转化条件优化。利用构建的表达系统，在詹氏丙酸杆菌中考察了多个关键酶的表达或敲除对丙酸杆菌细胞内代谢以及发酵生产丙酸(PA)的影响。同时，对基因工程菌进行了一系列营养条件和培养条件的发酵优化，有效地提升了詹氏丙酸杆菌发酵生产丙酸的能力。主要结论如下：P. jensenii ATCC4868是一株丙酸高产菌，为了进一步提高其发酵生产丙酸的能力，构建了一株詹氏丙酸杆菌-大肠杆菌穿梭载体用来对詹氏丙酸杆菌进行代谢改造。首先在P. acidipropionici ATCC4875中分离到一株内源野生质粒，将其命名为pZGX01，序列测序及分析显示pZGX01能够编码11种蛋白质。然后根据分析得到的信息，利用pZGX01、pUC18和氯霉素抗性基因构建了詹氏丙酸杆菌-大肠杆菌穿梭载体，命名为pZGX04，这株载体不仅能转化P. jensenii ATCC4868和P. jensenii ATCC4870，而且能转化P. freudenreichii subsp. freudenreichii ATCC6207。利用构建的穿梭载体，成功在P.jensenii ATCC4868中表达了甘油脱氢酶基因(gldA)，3L发酵罐利用优化的两阶段pH分批发酵策略，发酵基因工程菌P. jensenii (pZGX04-gldA)结果显示丙酸产量达到28.23g L-1，比出发菌株提高了26.07%。在3L发酵罐上通过整合分批补料模式和两阶段pH控制策略提高基因工程菌P.jensenii (pZGX04-gldA)发酵生产丙酸的能力。首先通过分析考察不同pH对基因工程菌生长和发酵的影响，提出了两阶段pH控制策略，即在发酵过程0-36h将pH控制在5.9，发酵36h后将pH提高到6.5，丙酸产量提高到21.43g L-1。在两阶段pH控制策略基础上，进一步研究了初始甘油浓度和甘油流加模式对菌体生长和发酵生产丙酸的影响。当初始甘油浓度为25g L-1，在发酵过程60-132h恒速流加3.33mL h-1甘油溶液(300g L-1)时，得到最高的丙酸产量，达到34.62g L-1。在3L发酵罐上利用三阶段氧化还原电位(ORP)控制策略提高基因工程菌P. jensenii(pZGX04-gldA)发酵生产丙酸的能力。通过分析研究不同ORP对基因工程菌生长和发酵的影响，提出了三阶段ORP控制策略，即在发酵过程0-36h控制ORP为-200mV，36-156h控制ORP为-300mV，156h后控制ORP为-400mV，丙酸产量从出发菌株的21.38g L-1提高到27.31g L-1。同时研究了不同ORP对基因工程菌胞内代谢的影响，结果显示ORP能够同时调节NADH/NAD+比率、电子传递链相关酶的活性以及代谢流分布。通过整合ORP控制策略、两阶段pH控制策略和分批补料发酵策略，最终丙酸产量提高到39.53g L-1。通过在詹氏丙酸杆菌中过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)和敲除乳酸脱氢酶基因(ldh)研究其对詹氏丙酸杆菌生长、丙酸合成以及胞内代谢的影响。通过结合两阶段pH控制和分批补料发酵策略，P. jensenii-Δldh (pZGX04-ppc)的丙酸产量比野生菌分批补料发酵提高了29.61%。同时研究了基因的表达和敲除对胞内代谢的影响，结果显示基因的表达和敲除能够影响胞内NADH/NAD+比率，进而影响胞内代谢流分布，最终影响细胞生长和丙酸的产量。通过共表达丙酸合成途径两个瓶颈代谢节点相应的酶，提高了基因工程菌发酵生产丙酸的能力。通过丙酸代谢途径中间产物添加实验确定瓶颈代谢节点，进而分别过量表达和共表达瓶颈代谢节点相应的酶，分别是甘油脱氢酶、苹果酸脱氢酶和延胡索酸水合酶。基因工程菌中相应酶的活性比出发菌株提高了3.85-8.11倍，相应基因的转录水平是出发菌株的2.91-8.11倍。其中共表达甘油脱氢酶和苹果酸脱氢酶能明显提高詹氏丙酸杆菌发酵生产丙酸的能力，结合两阶段pH控制和分批补料发酵策略，丙酸产量提高到46.41g L-1。