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寡孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）是第一种被公认的捕线虫性真菌，在生活史中，有寄生生长与腐生生长两种生长状态。在自然界中，当遇到线虫或其他因子刺激时，会产生用于捕捉线虫的捕食器。在研究A.oligospora捕食线虫的过程发现，在捕食线虫的过程，有一种粘附蛋白编码基因的表达水平显著上调。对这种粘附蛋白分析发现，它与人源Bystin（accession No.NP_004044）一致性为42.58%。
Bystin是一种最初在HT-H细胞中发现的粘附蛋白，bystin基因在真核生物中高度保守，分布广泛，在果蝇、哺乳动物及酵母细胞中均有发现。果蝇Bystin位于核糖体，参与细胞的生长。在哺乳动物细胞中，Bystin通常存在细胞质中，涉及细胞生长与粘附。在酵母细胞中，Enpl分布于核内参与40S亚基的合成和pre-rRNA的加工。随着研究的不断深入，Bystin越来越多的的功能被发现。对bystin基因的研究，益于更好的掌握生物体生长发育的分子机制。
本文以捕食线虫真菌A.oligospora为研究对象，初步探讨其Bystin样粘附蛋白(以下简称BYSL；其基因座位AOL_s00043g50，以下简称bysl）的亚细胞分布及其生物功能。利用基因敲除、原位标记、亚细胞定位、His-tag pull down等技术手段，对该基因亚细胞分布及功能进行探讨。期望通过本研究了解A.oligospora捕食器形态发生的分子机制。本文的主要研究内容和初步研究结果如下：
1）bysl基因敲除：利用Gibson组装技术，使用潮霉素(以下简称HygB)抗性基因替换bysl基因，构建基因敲除质粒。依据同源重组原理，在CaCl2/PEG介导下进行原生质体转化。首先，构建同源臂为1000bp的基因敲除质粒，通过原生质体转化，筛选出200株转化子，验证发现95%为敲减菌株，没有得到敲除菌株。重新构建同源臂长度为2500bp的敲除质粒。经原生质体转化，筛选出300株转化子，验证发现97%为敲减菌株,仍然没有得到敲除菌株。推断bysl可能是持家基因，完全敲除这一基因会产生致死现象，但对于多核生物来说，敲除部分细胞核内的bysl，其他的细胞核内的bysl仍然可以正常表达，对生物体进行补偿，维持生命。因此，虽未得到bysl敲除突变菌株，但却得到大量的bysl敲减菌株。
2）bysl原位荧光标记：利用Gibson组装技术，构建原位荧光标记质粒。依据同源重组的原理，在CaCl2/PEG的介导下进行原生质体转化，将bysl3’末端与单体红色荧光蛋白基因（mRFP）融合。共筛选了50株转化子，成功筛选出一株阳性菌株，转化效率为2%。对原位荧光标记菌株进行液滴培养，激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope）下观察，未观察到原位荧光标记菌株液出现显著的红色荧光。RT-RCR和Western blotting的实验结果表明mRFP基因在RNA和蛋白水平未表达。这表明mRFP基因与bysl是具有整合稳定性的，但RT-PCR和Western blotting的结果说明mRFP基因不具备表达和目标性状表现两个方面的稳定性。
3）BYSL亚细胞定位研究：首先在E.coli Rosetta中重组表达BSYL，亲和层析获得BSYL。从商业化的噬菌体文库中筛选BSYL的纳米抗体。构建表达载体，重组表达获得纳米抗体。ITC测定BYSL与纳米抗体的亲和力，但是由于蛋白容易发生聚集，导致蛋白浓度浓度较低，因此滴定未饱和，只能大体得出BYSL与纳米抗体之间的N值为0.133±0.0723，Kd值为0.237±0.0826μM，初步判断BYSL与纳米抗体间亲和力较高。用FITC标记纳米抗体，对A.oligospora菌丝进行穿膜处理，将标有FITC的纳米抗体与A.oligospora菌丝进行孵育。借助confocal和荧光染色技术对BYSL进行亚细胞定位的研究。从定位结果判定，BYSL的荧光信号主要在细胞质中，在细胞核部分没有明显的荧光信号。由此推断，BYSL是一种细胞质蛋白。
4）His-tag pull down研究：通过pull down的方法，以融合HIS-tag的BSYL蛋白为诱饵，寻找相互作用蛋白，SDS-PAGE结果表明，存在8条蛋白条带，可能与诱饵蛋白有相互作用的关系。对这8条蛋白条带进行质谱测序，分析了其中可信度最高的5种潜在互作蛋白分子，发现它们大多含有核糖体合成、核糖体亚基蛋白、蛋白质合成相关蛋白因子和酶、电子传递链复合体I亚基等功能结构域。初步推测位于A.oligospora细胞质的BYSL蛋白可能通过参与该真菌核糖体生物合成过程，从而调控真菌的生长与捕食器的形成。
Bystin是一种最初在HT-H细胞中发现的粘附蛋白，bystin基因在真核生物中高度保守，分布广泛，在果蝇、哺乳动物及酵母细胞中均有发现。果蝇Bystin位于核糖体，参与细胞的生长。在哺乳动物细胞中，Bystin通常存在细胞质中，涉及细胞生长与粘附。在酵母细胞中，Enpl分布于核内参与40S亚基的合成和pre-rRNA的加工。随着研究的不断深入，Bystin越来越多的的功能被发现。对bystin基因的研究，益于更好的掌握生物体生长发育的分子机制。
本文以捕食线虫真菌A.oligospora为研究对象，初步探讨其Bystin样粘附蛋白(以下简称BYSL；其基因座位AOL_s00043g50，以下简称bysl）的亚细胞分布及其生物功能。利用基因敲除、原位标记、亚细胞定位、His-tag pull down等技术手段，对该基因亚细胞分布及功能进行探讨。期望通过本研究了解A.oligospora捕食器形态发生的分子机制。本文的主要研究内容和初步研究结果如下：
1）bysl基因敲除：利用Gibson组装技术，使用潮霉素(以下简称HygB)抗性基因替换bysl基因，构建基因敲除质粒。依据同源重组原理，在CaCl2/PEG介导下进行原生质体转化。首先，构建同源臂为1000bp的基因敲除质粒，通过原生质体转化，筛选出200株转化子，验证发现95%为敲减菌株，没有得到敲除菌株。重新构建同源臂长度为2500bp的敲除质粒。经原生质体转化，筛选出300株转化子，验证发现97%为敲减菌株,仍然没有得到敲除菌株。推断bysl可能是持家基因，完全敲除这一基因会产生致死现象，但对于多核生物来说，敲除部分细胞核内的bysl，其他的细胞核内的bysl仍然可以正常表达，对生物体进行补偿，维持生命。因此，虽未得到bysl敲除突变菌株，但却得到大量的bysl敲减菌株。
2）bysl原位荧光标记：利用Gibson组装技术，构建原位荧光标记质粒。依据同源重组的原理，在CaCl2/PEG的介导下进行原生质体转化，将bysl3’末端与单体红色荧光蛋白基因（mRFP）融合。共筛选了50株转化子，成功筛选出一株阳性菌株，转化效率为2%。对原位荧光标记菌株进行液滴培养，激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope）下观察，未观察到原位荧光标记菌株液出现显著的红色荧光。RT-RCR和Western blotting的实验结果表明mRFP基因在RNA和蛋白水平未表达。这表明mRFP基因与bysl是具有整合稳定性的，但RT-PCR和Western blotting的结果说明mRFP基因不具备表达和目标性状表现两个方面的稳定性。
3）BYSL亚细胞定位研究：首先在E.coli Rosetta中重组表达BSYL，亲和层析获得BSYL。从商业化的噬菌体文库中筛选BSYL的纳米抗体。构建表达载体，重组表达获得纳米抗体。ITC测定BYSL与纳米抗体的亲和力，但是由于蛋白容易发生聚集，导致蛋白浓度浓度较低，因此滴定未饱和，只能大体得出BYSL与纳米抗体之间的N值为0.133±0.0723，Kd值为0.237±0.0826μM，初步判断BYSL与纳米抗体间亲和力较高。用FITC标记纳米抗体，对A.oligospora菌丝进行穿膜处理，将标有FITC的纳米抗体与A.oligospora菌丝进行孵育。借助confocal和荧光染色技术对BYSL进行亚细胞定位的研究。从定位结果判定，BYSL的荧光信号主要在细胞质中，在细胞核部分没有明显的荧光信号。由此推断，BYSL是一种细胞质蛋白。
4）His-tag pull down研究：通过pull down的方法，以融合HIS-tag的BSYL蛋白为诱饵，寻找相互作用蛋白，SDS-PAGE结果表明，存在8条蛋白条带，可能与诱饵蛋白有相互作用的关系。对这8条蛋白条带进行质谱测序，分析了其中可信度最高的5种潜在互作蛋白分子，发现它们大多含有核糖体合成、核糖体亚基蛋白、蛋白质合成相关蛋白因子和酶、电子传递链复合体I亚基等功能结构域。初步推测位于A.oligospora细胞质的BYSL蛋白可能通过参与该真菌核糖体生物合成过程，从而调控真菌的生长与捕食器的形成。