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双孔钾离子通道(two pore domain potassium channels,K2P)是 20 世纪 90 年代发现的一类新型钾离子通道,与传统的钾离子通道有所不同,它们的主要结构有四个横跨膜片段(M1-M4)以及两个结构域(P1、P2),即4TMS/2P结构。TREK-1在人体各种组织中都有分布,主要分布在中枢神经系统中,并且在大鼠和小鼠脑中都有广泛分布。随着科技发展,实验仪器的进步,人们对双孔钾通道的认识越来越深刻,许多研究表明TREK-1与脑缺血、脑卒中、抑郁中枢神经系统疾病相关,临床常用的治疗抑郁症的药物氟西汀就能明显的抑制TREK-1电流,经常被用来作为工具药。临床常用的一些挥发性麻醉剂比如氟烷、异氟烷都能够强烈的激活TREK-1,并且能够在脑缺血模型中发挥神经保护作用。全身麻醉剂氯胺酮、氯仿、依托咪酯对TREK-1也明显的激活作用。越来越多的科学研究表明TREK-1与人类多种疾病密切相关,对TREK-1的研究更值得我们深入和坚持。本论文主要利用膜片钳技术观察氯胺酮、依托咪酯对TREK-1的作用效果以及作用机制进行了初步研究。第一部分:氯胺酮对双孔钾通道TREK-1的电生理研究氯胺酮是一种静脉麻醉剂,临床上应用较为广泛。实验结果表明氯胺酮3、10、30、100 μM对TREK-1通道有明显激活作用,激活率分别为27.2±5.5%(n=4)、52.1±16.5%(n=5)、60.5±23.2%(n=5)、79.3%±19.5%(n=6),氯胺酮能够剂量依赖性的激活TREK-1。采用细胞内微透析方法观察氯胺酮10、30、100 μM也能够剂量依赖性激活TREK-1,激活率分别为18.6±9.2%(n=4),25.4±11.7%(n=5),43.5±20.9%(n=4),推测氯胺酮激活TREK-1作用的位点也存在于细胞内。温度也是双孔钾通道TREK-1的调控因素之一,使用温控器加温,观察到氯胺酮10μM在30℃时对TREK-1激活率为66.7±24.7%(n=4)明显高于氯胺酮10 μM在25℃时对TREK-1的激活率38.5±29.2%(n=3),氯胺酮和温度对TREK-1的激活能够协同发挥作用。氯仿为实验室经常使用的工具药,并且本实验室之前的结果表明氯仿对TREK-1具有一定的激活作用,本论文研究结果表明氯仿0.05、0.1、0.2 mM都能够强烈激活 TREK-1,激活率分别为 176.5±33.7%(n=5)、206.5±60.4%(n=5)、215.2± 48.2%(n=4),与氯胺酮相比氯仿的激活作用更强。实验结果表明氯胺酮能激活TREK-1,并且在细胞内外都能够发挥这一作用。除此之外,氯胺酮还能够和温度协同发挥对TREK-1的激活作用。氯仿对TREK-1也具有剂量依赖性激活作用,而且氯仿0.05 mM对TREK-1激活作用要强于氯胺酮100 μM对TREK-1的激活作用。可以考虑将氯仿在合适浓度范围内作为筛选TREK-1激活剂的阳性药。第二部分:依托咪酯对TREK-1的电生理研究本实验室前期研究表明,依托咪酯对TREK-1有激活作用,本论文根据本实验室前期研究,继续观察依托咪酯对TREK-1的调控机理。实验结果表明:依托咪酯3、10、15 μM对双孔钾通道TREK-1有明显的激活作用,分别能够激活到 115.0±3.9%(n=5,P=0.06)、142.1±16.3%(n=6,*P<0.05)、122.9±3.8%(n=4,*P<0.05),而依托咪酯 20、25、30、100 μM 对 TREK-1具有一定的抑制作用,分别能够抑制到96.2%±5.0%(n=5),90.3±14.3%(n=7),87.8±14.6%(n=8),70.3±8.8%(n=5,*P<0.05),上述结果表明依托咪酯对TREK-1为双向调控作用。在Graphpad Prism 5.0软件中使用单相指数衰减对依托咪酯浓度和变化率进行拟合,根据方程拟合方程y=(y0-plateau)*exp(-k*x)+plateau(y0=136.5 plateau=-28.70 k=0.08)计算出依托咪酯双向调节作用拐点为20.7 μM。观察了依托咪酯对电压依赖性钾通道Kv2.1的作用,从依托咪酯对Kv2.1的Ⅰ-Ⅴ曲线发现:依托咪酯在10 μM时对Kv2.1有轻微抑制作用,但是与对照组相比没有显著性差异;依托咪酯30 μM对Kv2.1也没有影响。为了验证依托咪酯对TREK-1的双向调节,分别观察依托咪酯10、30 μM对TREK-1 Ⅰ-Ⅴ曲线、静息膜电位和斜坡电流的影响。结果表明依托咪酯10μM、能够使TREK-1 Ⅰ-Ⅴ曲线左移,依托咪酯30μM对TREK-1 Ⅰ-Ⅴ曲线没有影响。依托咪酯10 μM组膜电位为-46.0±1.2 mV,对照组膜电位为-40.3±2.3 mV,依托咪酯10μM使TREK-1/CHO膜电位往超极化方向移动。依托咪酯30 μM组膜电位为-38.7±1.3 mV,对照组膜电位为-47.7±1.2 mV,依托咪酯30μM使TREK-1/CHO膜电位往去极化方向移动。斜坡电流刺激结果显示依托咪酯10μM能够明显使斜坡电流曲线左移,依托咪酯30 μM总趋势能够使斜坡电流曲线右移。研究表明TREK-1受酸度影响,依托咪酯10 μM时,增加细胞内酸度时依托咪酯对TREK-1的激活作用增加;依托咪酯30μM时,增加细胞内酸度依托咪酯对TREK-1的抑制作用更强。氯仿0.05、0.1、0.2 mM增加细胞内酸度比在正常细胞状态下对TREK-1的激活作用强,但是增加细胞外酸度对TREK-1没有显著性影响。结论:实验结果表明依托咪酯对TREK-1有双向调节作用,使用单相指数衰减对进行拟合,根据方程y=(y0-plateau)*exp(-k*x)+plateau(y0=138.50platue=-28.68 k=0.08),计算出依托咪酯双向调节作用拐点为20.7μM。依托咪酯10、30 μM对TREK-1 Ⅰ-Ⅴ曲线、静息膜电位以及斜坡电流刺激的影响结果均与上述结果一致。此外证明依托咪酯对TREK-1选择性强于Kv类钾通道。在增加细胞外、内酸度条件下观察了依托咪酯10、30μM对TREK-1的影响,结果表明在改变细胞内外酸度的情况下依托咪酯对TREK-1双向调节作用也存在。氯仿0.05、0.1、0.2 mM在增加细胞内酸度情况下比在正常细胞状态下对TREK-1的激活作用强,但是增加细胞外酸酸度,氯仿0.05、0.1、0.2 mM与正常细胞状态下相比增加细胞外酸度对TREK-1没有显著性影响。