由于社会、环境、经济等多种原因,不孕症已经成为一个全球公共健康问题,因此求助于辅助生殖技术(assisted reproductive technology, ART)治疗的人数也越来越多。ART是指对配子、胚胎或者基因物质进行体外操作,从而获得新生命的技术,包括常规体外受精(in vitro fertilization,IVF)、卵细胞浆内单精子显微注射技术(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)、冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer, FET)等。ART开展至今已30余年,在给不孕夫妇带来希望,解决其不孕问题的同时,一个值得关注的问题是其活产率仍然基化状态的焦磷酸测序分析和BSP测序分析3种印记基因甲基化状态分析见图1-2。其中,焦磷酸测序分析结果为A-C,BSP测序结果为a-c。(1)IGF2基因A.焦磷酸测序：Methylation%=47.而涉及人类组织标本的研究很少。ART正施于印记基因甲基化擦除和重建的窗口期,极有可能影响该过程而导致基因印记缺陷。此外,亦有研究表明某些印记基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与胎儿胎盘生长发育相关,且与甲基化状态相关,但是有关印记基因SNP与人类自然流产的研究报道较少。本研究收集了经ART受孕及自然受孕的绒毛组织,检测生长发育相关印记基因IGF2、GRB10、PEG3的甲基化状态,并进行研究对比,同时分析IGF2、GRB10SNP的情况,探讨ART对印记基因甲基化状态的影响,以及印记基因SNP,甲基化状态与自然流产发以及印记基因SNP,甲基化状态与自然流产发生之间的关系,为进一步评估ART技术的安全性提供依据,以及研究自然流产发生机制提供新的思路。第一部分人类自然流产绒毛组织印记基因IGF2、GRB10、PEG3甲基化状态的研究[研究目的]活产率低是ART妊娠后一个值得关注的问题。自然流产是引起ART妊娠后活产率低的一个主要原因。动物实验研究表明基因印记的缺陷可能会影响妊娠的维持,而ART正施于印记基因甲基化擦除和重建的窗口期,极有可能影响该过程而导致基因印记缺陷。本研究采用焦磷酸测序和重亚硫酸盐测序PCR技术,分析ART妊娠或自然妊娠来源的绒毛组织中印记基因I(GF2、GRB10、PEG3的甲基化状态,初步评估ART妊娠胚胎停止发育中印记异常的发生风险,为ART技术的表观遗传学安全性提供初步依据。[研究方法](1)本研究经医院伦理委员会批准,标本收集经患者知情同意。自2008年5月至2012年11月共收集人绒毛组织标本337份：①自然妊娠胚胎停育绒毛84例；②自然妊娠人工流产绒毛94例；③ART妊娠胚胎停育绒毛73例；④ART多胎妊娠减胎绒毛组织86例。所有标本均来源于南方医院妇产科门诊人流室、南方医院生殖医学中心、江西省妇幼保健院、广东省妇幼保健院。绒毛样本收集孕周为孕6-18周,母龄为17-45岁,母方无解剖学方面、感染等因素导致的流产、无家族遗传病史。孕周根据末次月经的时间计算,或末次月经不详者则参考B超结果。自然流产(胚胎停育)组患者B超检查提示：胚胎停止发育或停经6周后多次超声提示未见胚芽。(2)将绒毛标本清洗处理、提取DNA,采用重亚硫酸修饰基因组DNA后行IGF2、GRB10、PEG3基因目的片段PCR扩增,PCR产物采用焦磷酸测序法分析,得出每份标本的甲基化值,部分标本再行克隆测序验证。(3)采用SPSS16.0统计软件(Statistical Package for the Social Sciencesversion16.0),进行数据统计分析,数据根据情况选用均数±标准差(x±S)及百分比表示。两组间计量资料比较采用两独立样本t检验,若两组间样本方差不齐则采用Satterthwaite近似t检验；采用协方差分析以排除某些因素的影响；采用Boxplot分析数据分布得出离群值和极端值；两组样本间率的比较采用四格表χ2检验。设双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。[研究结果](1)取每种基因所检测的所有CpG位点之平均值作为该样本的甲基化值,IGF2、GRB10、PEG3基因的平均甲基化值分别为54.1±6.1(%)(波动范围18.5-79.3%)、48.6±11.0(%)(波动范围0-80.2%)、46.0±6.8(%)(波动范围24.6-71.9%),除GRB10出现两例完全未甲基化外完全非甲基化(0%)(均是胚胎停育绒毛组织)外,其余均未出现完全甲基化(100%)或完全非甲基化(0%)。Boxplot分析显示共有37例标本出现异常甲基化情况,其总体发生率为3.7%(37/1011),每种基因的异常甲基化值发生率呈现GRB10>IGF2>PEG3,分别为4.2%(14/337)、3.9%(13/337)、3.0%(10/337)。(2)根据受孕方式(是否行ART)将所有标本分为ART妊娠组和自然妊娠组,其中ART妊娠组共纳入159例患者,自然妊娠组共纳入178例患者。两组患者年龄及孕周比较,ART妊娠组年龄较自然妊娠组大(31.6±3.8vs.29.4±5.6),但孕周小于自然妊娠组(8.2±1.3vs.9.1±2.0),且差异均有统计学意义(Satterthwaite近似t检验,年龄：t=4.393,P<0.001：孕周：t=-4.824,P<0.001)。在两组中分别比较IGF2、GRB10、PEG3基因的甲基化水平差异,结果显示：三个印记基因的甲基化水平在两组间差异均无统计学意义[IGF2：t=1.534,P=0.126(两独立样本间t检验)(方差齐： P=0.136)；GRB10：t=1.218,P=0.224(Satterthwaite近似t检验)(方差不齐：P=0.001)；PEG3：t=-0.849,P=0.396(Satterthwaite近似t检验)(方差不齐：P=0.004)]。考虑年龄及孕周可能对结果产生影响,进一步采用协方差分析以排除二者对结果的影响。在校正了年龄和孕周后,协方差分析结果与独立样本间t检验结果一致(IGF2：F=3.625,P=0.058；GRB10:F=1.725,P=0.190；PEG3:F=0.434,P=0.510)。在两组中分别比较IGF2、GRB10、PEG3基因异常甲基化发生率,差异亦无统计学意义(采用四格表χ2检验。IGF2:x2=0.771,P=0.380；GRB10:X2=0.026,P=0.872；PEG3: x2=0.028,P=0.868)。将所有ART来源的绒毛组织标本根据受精方式分为IVF组和ICSI组。两组患者年龄及孕周比较差异无统计学意义[年龄：t=1.848,P=0.066(两独立样本t检验)(方差齐：P=0.069)；孕周：t=-1.628,P=0.107(Satterthwaite近似t检验)(方差不齐：P=0.028)],三种印记基因甲基化水平两组间的比较差异均无统计学意义(两独立样本t检验,IGF2:t=1.617,P=0.108:GRB10: t=-0.268,P=0.789:PEG3:t=-0.243,P=0.808),且异常甲基化发生率在两组间的比较差异无统计学意义(采用四格表χ2检验。IGF2:x2=0.564,P=0.453； GRB10:x2=0.017,P=0.896；PEG3:x2=0.357,P=0.550)。(3)将所有样本根据是否胚胎停育分为胚胎停育组和非胚胎停育组,胚胎停育组包括自然妊娠和ART妊娠自然流产的患者,共纳入157例患者,非胚胎停育组为自然妊娠人工流产及ART妊娠多胎减胎患者,共纳入180例患者。两组患者的年龄比较(31.0±4.8vs.30.0±5.0),差异无统计学意义[t=-1.605,P=0.109(两独立样本t检验)(方差齐,P=0.698)]；胚胎停育组的孕周大于非胚胎停育组(9.4±2.0vs.8.1±1.4),且差异有统计学意义[t=-6.636,P<0.001(Satterthwaite近似t检验)(方差不齐,P<0.001)]。采用分别比较IGF2、GRB10、PEG3基因在两组中的甲基化水平,结果显示：除PEG3差异无统计学意义外[t=0.654,P=0.513(Satterthwaite近似t检验)(方差不齐,P=0.031)],IGF2和GRB10两个印记基因的甲基化水平在两组间差异均有统计学意义,且均是胚胎停育组高于非胚胎停育组(两独立样本t检验,IGF2：55.0±5.2vs.53.4±6.8,t=-2.446,P=0.015:GRB10:49.9±10.8vs.47.5±11.1,t=-2.042,P=0.042)。考虑年龄及孕周可能对结果产生影响,进一步采用协方差分析以排除二者对结果的影响。在校正了年龄和孕周后,协方差分析结果与独立样本间t检验结果一致。两组间IGF2、GRB10、PEG3基因异常甲基化发生率的比例比较,结果显示：GRB10异常甲基化发生率在胚胎停育组显著高于非胚胎停育组,且差异有统计学意义(采用四格表χ2检验,χ2=5.001,P=-0.025),其余两个基因异常甲基化发生率在两组间比较差异无统计学意义(采用四格表χ2检验。IGF2:8/157vs.9/180, x2=0.002,P=0.968；PEG3:2/157vs.6/180,P=0.215)。[研究结论](1)辅助生殖技术可能并不影响绒毛组织印记基因IGF2、GRB10、PEG3的甲基化状态,也不增加异常甲基化状态的发生；且与IVF比较,ICSI并不增加表观遗传学异常的风险；(2)绒毛组织印记基因IGF2、GRB10的甲基化水平在胚胎停育组高于非胚胎停育组,且差异有统计学意义(IGF2：55.0±5.2vs.53.4±6.8,t=-2.446,P=0.015:GRB10:49.9±10.8vs.47.5±11.1,t=-2.042,P=0.042),而PEG3的甲基化水平在两组间无显著差异外(45.7±7.2vs.46.2±6.4,t=0.654,P=0.5130,提示绒毛组织印记基因IGF2、GRB10的甲基化水平可能与自胚胎停育有关,而PEG3可能不参与该过程,提示表观遗传学的异常也可能是导致自然流产的重要因素之一；(3)本研究无法确定是甲基化状态异常导致了胚胎停育的发生,还是胚胎停育发生后DNA甲基化水平发生了改变,且本研究仅限于对少数印记基因部分差异性甲基化区的DNA甲基化状态的研究,进一步工作需要进行全基因甲基化水平检测,以及RNA、蛋白水平的研究,以证实上述的初步研究结论。第二部分人类自然流产绒毛组织印记基因IGF2、GRB10单核苷酸多态性研究[研究目的]SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,占所有已知多态性的90%以上,与人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等相关。目前研究利用SNP技术进行自然流产易感基因的筛选,但多局限于与免疫相关的基因。印记基因作为一类特殊基因,在人类的生长发育中扮演着重要角色。近年来关于印记基因的SNP研究发现某些印记基因的SNP可能与胎儿胎盘生长发育,新生儿出生体重等有关,亦有研究表明印记基因的SNP位点可能与甲基化水平紧密相关。本部分以经ART获得妊娠的早孕期自然流产绒毛、减胎绒毛、及自然受孕早/中期正常绒毛和自然受孕早孕期自然流产绒毛组织为研究对象,采用焦磷酸测序方法对IGF2rs3741205、rs3741206、rs3741211三个位点及GRB10rs2237457位点的SNP进行了检测,并构建rs3741205、rs3741206、rs3741211单倍型,以探讨这些位点与人类自然流产的相关性,及ART技术对这Lancet.1998,35流产的发生机制提供依据。[研究方法](1)本研究经医院伦理委员会批准,标本收集经患者知情同意。标本收集同第一部分。将绒毛标本清洗处理、提取DNA后,行IGF2、GRB10、PEG3基因目的片段PCR扩增,PCR产物采用焦磷酸测序法检测SNP,对每份标本进行基因分型,并选取部分标本采用DNA测序加以验证。(2)将所有标本根据是否行ART治疗分为自然妊娠和ART妊娠,每组再分胚胎停育和非胚胎停育两个亚组。采用SPSS16.0统计软件进行数据统计分析,数据用百分比,或均数±标准差(x±S)表示。两组间基因型分布频率的比较采用x2检验,两组间计量资料比较采用独立样本t检验。Hardy-weinberg平衡检验采用拟合优度x2检验；连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)以及单倍型(haplotype)分析均采用SHEsis软件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)。设双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。[研究结果](1)共纳入337例患者,其中ART妊娠组共159例患者,自然妊娠组共178例患者。IGF2rs3741205、rs3741206、rs3741211位点以及GRB10rs2237457位点在两组中的基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡(采用拟合优度x2检验。rs3741205——ART妊娠组：x2=0.902,P=0.637;自然妊娠组：x2=0.051,P=0.975; rs3741206——ART妊娠组：x2=0.306, P=0.858;自然妊娠组：x2=3.662,P=0.160;rs3741211——ART妊娠组：x2=1.558,P=0.459；自然妊娠组：χ2=0.307,P=0.858;rs2237457——ART妊娠组：χ2=0.017,P=0.992；自然妊娠组：χ2=2,994,P=0.229)。因变异的等位基因出现频率较低,故将含有突变等位基因的基因型(包括杂合突变型和纯合突变型)合为一组与野生型进行比较,统计结果显示绒毛组织的IGF2rs3741205.rs3741206.rs3741211及GRB10的rs2237457位点野生型与突变型在胚胎停育组与非胚胎停育组中的分布差异无统计学意义(采用χ2检验。rs3741205:x2=0.064,P=0.801；rs3741206:x2=0.625,P=0.429； rs3741211:x2=0.006,P=0.936；rs2237457:x2=0.072,P=0.789)。(2)在自然妊娠组,其中胚胎停育组共84例患者,非胚胎停育组共94例患者。IGF2rs3741205.rs3741206.rs3741211位点以及GRB10rs2237457位点在两个亚组中的基因型分布频率均符合]Hardy-Weinberg平衡(采用拟合优度χ2检验。rs3741205——胚胎停育组：χ2=1.354,P=0.508；非胚胎停育组：χ2=0.598,P=0.742:rs3741206——胚胎停育组：χ2=2.394,P=0.302；非胚胎停育组：χ2=1.385,P=0.500:rs3741211——胚胎停育组：Z=0.811,P=0.667；非胚胎停育组：χ2=0.007,P=0.996:rs2237457——胚胎停育组：χ2=0.096,P=0.953；非胚胎停育组：χ2=4.165,P=0.125)。统计结果显示绒毛组织的IGF2rs3741205.rs3741206.rs3741211及GRB10的rs2237457位点野生型与突变型在胚胎停育组与非胚胎停育组中的分布差异无统计学意义(采用χ2检验。rs3741205:x2=2.049,P=0.152；rs3741206: x2=0.606,P=0.436；rs3741211:x2=0.089,P=0.765；rs2237457:x2=0.014,P=0.905)。(3)在ART妊娠组中,共纳入159例患者,其中胚胎停育组共73例患者,非胚胎停育组(多胎减胎)共86例患者。IGF2rs3741205.rs3741206、rs3741211位点以及GRB10rs2237457位点在两个亚组中的基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡(采用拟合优度χ2检验。rs3741205——胚胎停育组：x2=0.366,P=0.833；非胚胎停育组：x2=3.415,P=0.181；rs3741206—一胚胎停育组：x2=0.264,P=0.876；非胚胎停育组：x2=1.436,P=0.488；rs3741211——胚胎停育组：χ2=3.211,P=0.201；非胚胎停育组：χ2=0.000,P--1.000；rs2237457——胚胎停育组：χ2=0.703,P=0704.；非胚胎停育组：χ2=0.359,P=0.836)。统计结果显示在ART妊娠绒毛组织中IGF2基因rs3741211位点TT野生型与TC+CC突变型在胚胎停育组和非胚胎停育组中的分布有差异,TC+CC突变型在胚胎停育组中升高(采用χ2检验。χ2=3.973,P=0.046,OR值：1.912,95%可信区间：1.008-3.629)。其余IGF2rs3741205、rs3741206及GRB10的rs2237457位点在两组中的分布差异无统计学意义(采用χ2检验。s3741205:x2=1.887,P=0.170； rs3741206:x2=0.955,P=0.328；rs2237457:x2=0.363,P0.547)。在该组患者中(ART妊娠组)进一步分析了IGF2rs3741211位点TT野生型及TC+CC突变型两种基因型与IGF2、H19、KvDMR1三个印记基因甲基化水平的差异。结果显示,IGF2rs3741211位点TC+CC突变型的KvDMR1甲基化水平比TT野生型高(51.2±11.8vs.47.5±7.3),且差异有统计学意义(采用Satterthwaite近似t检验,t=-2.007,P=0.048)。而IGF2、H19的甲基化水平在两组之间比较,虽然TC+CC突变型也比TT野生型高,但差异无统计学意义(IGF2方差不齐：P=0.036,采用Satterthwaite近似t检验,t=-0.549,P=0.584；H19方差齐：P=0.083,采用两独立样本t检验,t=-I.215,P=0.227)。应用SHEsis分析软件对IGF2rs3741205、rs3741206、rs3741211三个位点的连锁不平衡分析,结果显示,三个位点间存在较强的连锁不平衡。三个位点构建单倍型,共构建8种单倍型,分别为：GAT、GGT、TAC、TAT、TGC、TGT、GAC、GGC。由于TAT、TGC、GAC以及GGC四种单倍型在两组中的分布频率均小于0.03,故不做分析。其余四个单倍型经卡方检验后,GAT、TAC、TGT三种单倍型在ART妊娠胚胎停育组与非胚胎停育组中的分布差异均无统计学意义,而GGT单倍型在两组间的分布有差异(胚胎停育组vs.非胚胎停育组：4%vs.0.7%,χ2=3.896,P=0.048),但不是ART妊娠自然流产发生的危险因素(OR值：5.640,95%可信区间：0.821-38.761)。[研究结论](1)ART并不影响IGF2rs3741205、rs3741206、rs3741211及GRB10的rs2237457位点的多态性；(2)人绒毛组织DNA IGF2rs3741205、rs3741206、rs3741211及GRB10的rs2237457位点与自然妊娠胚胎停育无关。在ART妊娠中,人绒毛组织IGF2rs3741211位点TC+CC突变型可能与ART妊娠胚胎停育相关,且该基因型可能与KvDMR1基因甲基化水平相关。IGF2rs3741205、rs3741206、rs3741211三个位点GGT单倍型可能与ART妊娠胚胎停育有关——ART妊娠胚胎停育组分布高于非胚胎停育组,但由于样本量较小尚不能肯定其是否是ART妊娠胚胎停育发生的危险因素。而其他位点均与ART妊娠胚胎停育无关。(3)本研究样本量较小,需进一步扩大样本量以证实上述的初步研究结论。同时也需要进行相关SNP的功能研究。