目的:腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm,AAA）的定义为因动脉中膜结构破坏,在血液压力的冲击下,主动脉发生永久性扩张或膨出,最终导致腹主动脉超过正常腹主动脉管径的50%以上[1]。流行病学资料显示,在人群中AAA较为常见,其破裂会严重危及生命[2-4]。自2000年以来,拉丁美洲以及一些高收入亚太地区国家统计表明,AAA的患病率有所上升[5-6]。在美国,由AAA破裂所导致的死亡在该国所有死亡原因排名中占第13位,据估计每年可导致约15000人死亡[7]。在我国,研究表明男性65岁以后,AAA的发病率每10年增加6%。除性别外,目前已知的危险因素还包括吸烟、高血压、既往心肌梗死病史和外周动脉疾病等[8]。随着我国逐渐进入老龄化社会,上述危险因素的增加使AAA的发病率呈明显上升趋势,给我国社会和经济的发展带来了沉重的负担。目前,尚无有效药物治疗策略能阻止AAA的进展和破裂,血管内或开放式手术修复是唯一可行的方法。因此,探索AAA的发生及进展机制是该领域中亟待解决的热点和难点问题。AAA的发生、进展以及最终血管破裂的病理机制尚未完全阐明。目前普遍认为炎症细胞浸润、细胞外基质破坏以及血管平滑肌细胞（vascular smooth cell,VSMCs）凋亡等病理变化在AAA的发生发展过程中发挥重要的作用[9-11]。其中,VSMCs表型转换是目前研究的热点。VSMCs表型转换是指VSMCs在受到病理性因素刺激时,由收缩表型转换为合成表型。既往研究表明,在高血压、动脉粥样硬化或其他可能引起炎症的病理因素刺激下,收缩表型的VSMCs将炎症限制在外膜以限制蛋白水解。随着致病因素的持续作用,VSMCs由收缩表型转换为分泌表型,其中,分泌的基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase2,MMP2）具有强烈的降解弹性蛋白和胶原蛋白的作用,是导致主动脉内侧膜破坏和动脉瘤形成的重要因素[12]。但是,调控VSMCs表型转换及MMP2分泌增加的具体分子机制仍未阐明。E1A激活基因阻遏子基因（cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG）于1998年由美国哈佛大学医学院Gill教授首次报道,是从子宫颈内膜癌Hela细胞c DNA文库中克隆出的一个转录相关调控因子[13]。人CREG基因c DNA全长663bp,由220个氨基酸构成[14]。此前,Veal等将CREG基因导入畸胎瘤细胞进行体外培养,发现CREG不仅抑制细胞增殖,还能促进畸胎瘤细胞向神经细胞的自发性分化,提示CREG可能是一个诱导细胞分化的内稳态调控因子[15]。韩雅玲院士及其团队针对CREG在VSMCs中的作用进行了多年的系统研究,结果发现:第一,CREG蛋白在胚胎9.5d（E9.5）胚胎血管单层内皮细胞中开始表达,在E10.5d开始在血管VSMCs和周细胞中表达,直到血管成熟[16]。在此过程中,CREG发挥重要的胚胎血管细胞发育及成熟的生物学调控作用;第二,CREG在血管损伤等多种病理因素作用下,均发挥重要的调控作用[17,18];第三,CREG基因过表达可促进VSMCs分化、抑制其凋亡、增殖和迁移[19];第四,CREG是高血压所导致的血管重塑的重要调控因子[20]。上述结果表明,CREG通过调控VSMCs稳态参与多种血管疾病的发生发展。因此,本研究旨在明确CREG在AAA形成及发展过程中的作用,并进一步通过免疫共沉淀联合质谱分析技术,探讨CREG发挥作用的具体分子机制,为防治AAA提供新的实验基础。研究方法:1.建立AAA小鼠模型方法:选择雄性8周龄Apo E-/-小鼠,通过皮下植入含有血管紧张素II（angiotensin II,Ang II）的微渗透泵构建AAA模型,对照组给予生理盐水（Saline）作为对照,利用小动物超声,检测1w、2w、3w和4w时间点小鼠腹主动脉最大直径以及AAA形成情况。尾套法测量上述时间点小鼠血压。第28d,在麻醉状态下处死小鼠收集主动脉并评价AAA形成情况。对AAA进行Masson染色评价纤维化、EVG染色评价弹力纤维降解。免疫组化（immunohistochemical,IHC）和免疫荧光（immunofluorescence,IF）染色检测α-SMA、MMP2在细胞或组织中的表达及定位,Western blot以及定量PCR分别检测细胞及组织中的CREG、α-SMA、MMP2/9等蛋白水平和m RNA水平。2.检测Apo E-/-小鼠在AAA形成过程中,腹主动脉中CREG表达变化方法:选择雄性8周龄Apo E-/-小鼠,通过皮下植入含有Ang II的微渗透泵构建AAA模型,分别收集0d、3d、7d、14d及28d的腹主动脉,Western blot检测不同时间点AAA主动脉组织中CREG的表达变化。3.通过给予外源性CREG蛋白,观察CREG对AAA是否具有治疗作用方法:选择雄性8周Apo E-/-小鼠,通过皮下植入含有Ang II的微渗透泵建立AAA疾病模型或给予Saline作为对照。两组小鼠分别通过皮下埋置微渗透泵的方式给予重组His-CREG蛋白或Saline对照,形成以下分组:Saline组,Ang II组,Ang II+His-CREG组,利用小动物超声,检测1w、2w、3w、4w时间点小鼠腹主动脉最大直径以及AAA形成情况。尾套法测量上述时间点小鼠血压。第28d,在麻醉状态下处死小鼠收集主动脉并评价AAA形成情况。对AAA血管组织进行Masson染色评价纤维化,EVG染色评价弹力纤维降解。IHC/IF染色检测蛋白在组织中的CREG、α-SMA、MMP2/9表达及定位,Western blot以及定量PCR检测分别检测细胞及组织中的CREG、α-SMA、MMP2/9蛋白水平和m RNA水平。4.利用CREG转基因小鼠（CREG transgenic mice,Tg-CREG）,明确内源性CREG在AAA发生发展过程中的作用方法:选择雄性8周龄Apo E-/-背景的Tg-CREG小鼠及其同窝非转基因的对照小鼠,通过皮下泵入Ang II构建AAA模型。形成以下分组:Ang II组和Ang II+Tg-CREG组。检测指标同上。5.明确外源性CREG对由Ang II诱导的VSMCs合成MMP2的影响方法:通过IHC染色及Western blot,检测外源性给予CREG蛋白和/或Ang II组小鼠,腹主动脉中MMP2的表达6.明确VSMCs受到Ang II刺激时,CREG与MMP2表达变化的相关性方法:为了模拟在体AAA这一疾病状态,向VSMCs中加入Ang II（1μM）刺激建立离体细胞模型。应用Western blot检测VSMCs在受到Ang II刺激后,在0h、24h、36h及48h不同时间点CREG及MMP2的表达,选择最开始出现明显变化的时间点作为最佳刺激时间。7.明确离体状态下,CREG是否有调控MMP2的作用方法:在VSMCs中通过转染Ad-CREG腺病毒过表达CREG（对照组给予Ad-GFP腺病毒）,分组后给予Ang II（1μM）刺激,形成以下分组:NS+Ad-GFP,NS+Ad-CREG,Ang II+Ad-GFP,Ang II+Ad-CREG。通过Western blot检测MMP2表达的变化。8.明确离体状态下,CREG发挥调控MMP2的作用是在转录水平还是蛋白水平方法:在VSMCs中通过转染Ad-CREG腺病毒过表达CREG（对照组给予Ad-GFP腺病毒）,分组后给予Ang II（1μM）刺激或空白对照,形成以下分组:NS+Ad-GFP,NS+Ad-CREG,Ang II+Ad-GFP,Ang II+Ad-CREG。通过q RT-PCR检测各组MMP2表达的变化。9.筛选与CREG相互作用的蛋白方法:既往本实验室在研究与CREG相互作用的蛋白时,将带有His标签的重组人CREG蛋白加入到VSMCs细胞中,通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）技术获得与CREG相结合的蛋白沉淀,通过质谱分析技术（公司提供）对该蛋白沉淀进行成分检测分析。10.根据质谱发现的CREG相互作用蛋白,寻找其中可能调控MMP2表达的转录因子方法:搜索与调节MMP2有关的转录因子,共找到文献123篇,筛查明确为调节MMP2的转录因子,共有文献50篇,结合所得到的质谱分析结果,寻找调控MMP2且与CREG结合的转录因子。11.明确YY1与AAA形成的相关性方法:应用Western blot方法,检测YY1在AAA小鼠以及对照组小鼠主动脉中的表达。12.离体实验明确转录因子YY1在受到Ang II刺激时在胞浆及胞核中表达的变化方法:小鼠VSMCs给予Ang II（1μM）分别刺激0h、24h、48h、72h,通过Western blot方法检测YY1在胞浆及胞核中的蛋白表达。13.离体实验明确YY1在受到Ang II刺激时的入核转位变化方法:小鼠VSMCs给予Ang II（1μM）分别刺激0h、24h、48h、72h,通过免疫荧光检测YY1的入核转位情况。14.离体实验明确YY1在受到Ang II刺激条件下在胞浆蛋白中表达减少,CREG是否具有阻止该效应的作用方法:小鼠VSMCs通过转染腺病毒Ad-CREG过表达CREG,给予Ang II刺激,通过Western blot方法检测YY1在胞浆中的蛋白表达。15.离体实验明确YY1在受到Ang II刺激条件下入核,CREG是否具有阻止该效应的作用方法:在小鼠VSMCs中通过转染Ad-CREG腺病毒过表达CREG（对照组转染Ad-GFP腺病毒）,分组后给予Ang II（1μM）刺激或PBS,形成以下分组:Ad-GFP,Ad-CREG,Ang II+Ad-GFP,Ang II+Ad-CREG。通过免疫荧光染色及Western blot检测YY1在胞浆及胞核中的表达。16.明确CREG与YY1的具体结合位点方法:小鼠VSMCs中,通过转染Ad-YY1和Ad-CREG,24h后收集胞浆蛋白,进行Co-IP实验,采用CREG抗体进行Co-IP,采用YY1抗体进行免疫印迹分析;小鼠VSMCs中,通过转染Ad-YY1和Ad-CREG,24h后收集胞浆蛋白,采用YY1抗体进行Co-IP,采用CREG抗体进行免疫印迹分析;原代VSMCs转染Ad-YY1,并给予His-N100的CREG肽段,进行Co-IP实验,采用His抗体进行免疫共沉淀,采用YY1抗体进行免疫印迹分析;原代VSMCs转染Ad-YY1,并给予His-C91的CREG肽段,进行Co-IP实验,采用His抗体进行免疫共沉淀,采用YY1抗体进行免疫印迹分析。结果:1.CREG在小鼠AAA组织中表达下降,与Ang II刺激存在时间依赖性,提示CREG表达水平与AAA的发生、发展呈负相关关系。2.外源性给予重组CREG蛋白可抑制由Ang II刺激导致的AAA形成及进展。3.内源性过表达CREG可抑制由Ang II刺激导致的AAA形成及进展。4.在体水平,CREG可抑制Ang II刺激导致的主动脉中MMP2的表达增加;在细胞水平,过表达CREG可抑制Ang II诱导的VSMCs中MMP2表达的增加。5.在体水平,过表达CREG可抑制Ang II诱导的YY1在胞浆蛋白中的表达减少。在细胞水平,过表达CREG可阻止Ang II诱导的VSMCs中YY1入核转位。这表明CREG可能通过调控YY1入核转位从而发挥抑制MMP2转录的作用。6.在细胞水平,CREG与YY1存在结合,具体为CREG中的N-100肽段与YY1有结合。结论:总之,本研究初步证明,CREG具有抑制AAA的作用,可能是通过CREG蛋白的N100肽段与YY1结合,从而抑制YY1在VSMCs受到Ang II刺激时入核,进而抑制了MMP2的转录。